マウス島の口内皮下白色脂肪組織(ISWAT)移植モデル
Summary
このプロトコルでは、マウスの小口分離および、皮下白色脂肪組織への移植の方法が記載されている。単離された同系マウス島は、基質膜ヒドロゲルを用いてマウスレシピエントに移植される。レシピエントの血糖値をモニターし、そして、血小移植片のヒストロジー分析を行う。
Abstract
膵島移植は、1型糖尿病に対する十分に確立された治療療法である。腎臓カプセルは、げっ歯類モデルにおける小便の移植に最も一般的に使用される部位である。しかし、タイトな腎臓カプセルは、大型動物およびヒトにおける十分な小島の移植を制限する。新しい皮下空間である創尿下白脂肪組織(ISWAT)は、小便座移植にとって潜在的に貴重な部位であることが判明した。このサイトは、他の皮下空間よりも優れた血液供給を有する。また、ISWATは、腎臓カプセルよりも大きな小便の質量を収容し、それに移植することは簡単である。本稿では、同系糖尿病マウスレシピエントのISWAT部位におけるマウスの膵野の分離および移植の手順について説明する。このプロトコルを用いて、マウス膵島を、ISWAT部位の精製された小島を固定するために標準的なコラゲナーゼ消化および基質膜マトリックスヒドロゲルによって単離した。レシピエントマウスの血糖値を100日以上モニタリングした。この座子移植片は、組織学的分析のために移植後100日目に回収した。本稿に記載されているISWATサイトにおける、このサイトにおける小便の移植に関するプロトコルは、簡素で効果的である。
Introduction
国際糖尿病連盟(IDF)1の統計データによると、1型糖尿病(T1DM)の世界的な発生率と罹患率は急速に上昇しています。Islet移植は、T1DM4を治療するための最も有望なアプローチの1つである。エドモントンプロトコル2を用いた臨床島移植で行われた大きなブレークスルーが報告されていたので、5年後のT1DMレシピエントにおける機能性のスチーム移植片生存率は現在約50%3に達する。
これまで、肝臓、腎臓カプセル、脾臓、筋肉内領域、皮下空間、骨髄、およびオーメンタルポーチなどのいくつかの移植部位が実験的なポレット移植5、6、7について検討された。上記のサイトのいくつかは臨床設定8でテストされています。肝臓への小便の移植は現在9の臨床応用において最も広く用いられている方法であるが、この部位を使用する場合に対処すべきいくつかの重要な問題がある。例えば、即時血液媒介性炎症反応(IBMIR)および酸素供給不良10、11によって引き起こされる移植された小島の早期喪失を低減する方法、および必要に応じてこの島移植片を取り出す方法は、肝臓にびらんに局在化するためである。腎カプセルはげっ歯類のレシピエントにとって理想的な部位である可能性があります。しかし、タイトな腎臓カプセルは、ヒトにおける十分な同種間血島の移植を制限し、臨床的に使用される高度に精製されたブタ島の製剤に起因する異種移植に適している可能性があるが5、12。従って、より適した部位を探して、このサイトを、小便の移植が進んでいる。
皮下腔は、そのアクセス性のために、小便座移植のための臨床的に適用可能な部位として使用され得る。しかしながら、皮下空間への小島移植の効率は極めて低く、したがって高血糖13を逆にするために比較的多数の島を必要とする。最近、日本の研究チームは、ISWAT、肝臓14と比較してマウスモデルでの小便移植に優れた新しい皮下サイトを発見しました。ISWATは上胃動脈および静脈を含むので、豊富な血液供給は、小便移植片の再血管再生を保証することができる。本稿では、ISWATにおける同系マウス島の固定に基質膜マトリックスヒドロゲルを用いた容易な移植方法を提案する。このプロトコルは、小便の移植に有効であることが証明されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
膵臓膵島移植は、T1DMを治療するための有望な治療法です。この療法の効果は多くの要因によって影響を受け、小便座移植のための最適な部位を選択することは非常に重要である。この小便座移植の理想的な解剖学的部位には、単純な移植、生検、移植片の検索手順に対するアクセス性があります。合併症を減らしました。血糖コントロールの高い成功率;そして、小口移植片15、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国の国家主要R&Dプログラム(2017YFC1103704)広東省の高レベル病院建設のための特別資金(2019年)、深センの三明医学プロジェクト(SZSM201412020)、高レベル基金からの助成金によって支えられました。深センの医療規律建設(2016031638)、深セン科学技術財団(JCJY20160229204849975、GJHZ20170314171714171314171333年、深セン保健家族計画委員会(SZXJ2010102010100年10月20日)中国広東省科学研究財団(A2019218)、中国ポドカルサイエンス財団(2018M633218)。
Materials
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
References
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