Ein neues Toolkit zur Bewertung von Genfunktionen mit bedingter Cas9-Stabilisierung
Summary
Hier beschreiben wir ein Genom-Editing-Tool, das auf der zeitlichen und bedingten Stabilisierung des geclusterten, regelmäßig interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) assoziierten Proteins 9 (Cas9) unter dem kleinen Molekül Shield-1 basiert. Die Methode kann für kultivierte Zellen und Tiermodelle verwendet werden.
Abstract
Die CRISPR/Cas9-Technologie (CRISPR-) (Clustered Short Palindromic Repeat- 9) ist zu einem weit verbreiteten Laborwerkzeug geworden, um genaue und gezielte Modifikationen im Genom einzuführen. Seine enorme Popularität und schnelle Verbreitung werden auf seine einfache Bedienung und Genauigkeit im Vergleich zu seinen Vorgängern zurückgeführt. Die konstitutive Aktivierung des Systems hat jedoch nur begrenzte Anwendungen. In diesem Artikel beschreiben wir eine neue Methode, die eine zeitliche Kontrolle der CRISPR/Cas9-Aktivität basierend auf der bedingten Stabilisierung des Cas9-Proteins ermöglicht. Die Verschmelzung einer engineered Mutante des Rapamycin-bindenden Proteins FKBP12 mit Cas9 (DD-Cas9) ermöglicht den schnellen Abbau von Cas9, der wiederum durch das Vorhandensein eines synthetischen FKBP12-Liganden (Shield-1) stabilisiert werden kann. Im Gegensatz zu anderen induzierbaren Methoden kann dieses System leicht angepasst werden, um bi-cistronische Systeme zu erzeugen, um DD-Cas9 mit einem anderen Gen von Interesse zu koexprimieren, ohne bedingte Regulation des zweiten Gens. Diese Methode ermöglicht die Generierung rückverfolgbarer Systeme sowie die parallele, unabhängige Manipulation von Allelen, auf die die Cas9-Nuklease abzielt. Die Plattform dieser Methode kann für die systematische Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene und die Abfrage der funktionellen Interaktionen von Genen in in vitro und in vivo Settings genutzt werden.
Introduction
CRISPR-Cas9, das für“clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9”steht,wurde erstmals im Rahmen von Studien zur bakteriellen adaptiven Immunität1,2entdeckt. Heute ist CRISPR/Cas9 das bekannteste Werkzeug für programmierbare Genbearbeitung und verschiedene Iterationen des Systems wurden entwickelt, um transkriptionelle und epigenetische Modulationen zu ermöglichen3. Diese Technologie ermöglicht die hochpräzise genetische Manipulation nahezu jeder DNA-Sequenz4.
Die wesentlichen Bestandteile jeder CRISPR-Genbearbeitung sind eine anpassbare Guide-RNA-Sequenz und die Cas9-Nuklease5. Der RNA-Guide bindet an die zielprolementarische Sequenz in der DNA und weist die Cas9-Nuklease an, an einem bestimmten Punkt im Genom einen Doppelstrangbruch durchzuführen3,4. Die resultierende Spaltstelle wird dann durch nicht-homologe Endfügung (NHEJ) oder homologiegerichtete Reparatur (HDR) repariert, mit der daraus resultierenden Einführung von Veränderungen in der zielgerichteten DNA-Sequenz5.
CRISPR/Cas9-basierte Genbearbeitung ist einfach zu bedienen und relativ kostengünstig im Vergleich zu früheren Gen-Editing-Techniken und hat sich in einer Vielzahl von Systemen als effizient und robusterwiesen 2,4,5. Das System stellt jedoch einige Einschränkungen dar. Es wurde oft gezeigt, dass die konstitutive Expression von Cas9 zu einer erhöhten Anzahl von Off-Targets und einer hohen Zelltoxizitätführt 4,6,7,8. Darüber hinaus nimmt das konstitutive Targeting von essentiellen und Zellüberlebensgenen durch Cas9 seine Fähigkeit, bestimmte Arten von funktionellen Studien wie kinetische Studien des Zelltods durchzuführen7.
Verschiedene induzierbare oder bedingt gesteuerte CRISPR-Cas9-Tools wurden entwickelt, um diese Probleme zu lösen6, wie Tet-ON und Tet-Off9; standortspezifische Rekombination10; chemisch induzierte Nähe11; inteinabhängiges Spleißen3; und 4-Hydroxytamoxifen Östrogenrezeptor (ER) basierte kerne Lokalisationssysteme12. Im Allgemeinen bieten die meisten dieser Verfahren (Intein-Spleißen und chemisch induzierte Proximity-Split-Systeme) keine reversible Kontrolle, zeigen eine sehr langsame kinetische Reaktion auf die medikamentöse Behandlung (Tet-On/Off-System) oder sind für Hochdurchsatzmanipulationen nicht zugänglich6.
Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein neuartiges Toolkit entwickelt, das nicht nur eine schnelle und robuste zeitgesteuerte Genbearbeitung ermöglicht, sondern auch Rückverfolgbarkeit, Abstimmbarkeit und Zugänglichkeit zur Genmanipulation mit hohem Durchsatz gewährleistet. Diese neuartige Technologie kann in Zelllinien, Organoiden und Tiermodellen eingesetzt werden. Unser System basiert auf einer entwickelten Domäne, die, wenn sie mit Cas9 verschmolzen ist, ihren schnellen Abbau induziert. Es kann jedoch schnell mit einem hochselektiven, ungiftigen, zelldurchlässigen kleinen Molekül stabilisiert werden. Genauer gesagt haben wir die humane FKBP12-Mutante “destabilisierende Domäne” (DD) zu Cas9 entwickelt und Cas9 für einen schnellen und konstitutiven Abbau über das Ubiquitin-Proteasom-System markiert, wenn es in Säugetierzellen exprimiert wird13. Der synthetische DD-Ligand Shield-1 kann die DD-Konformation stabilisieren und dadurch den Abbau von proteinen, die mit DD verschmolzen sind (wie Cas9), auf sehr effiziente Weise und mit einer schnellen kinetischen Reaktion verhindern14,15. Bemerkenswert ist, dass Shield-1 mit drei Größenordnungen enger an die Mutante FKBP12 bindet als an sein Wildtyp-Gegenstück14.
Das DD-Cas9/Shield-1-Paar kann verwendet werden, um die systematische Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene in kultivierten Zellen und Tiermodellen zu untersuchen, wie wir zuvor gezeigt haben, indem wir bedingt auf das CypD-Gen abzielen, das eine wichtige Rolle im Stoffwechsel der Mitochondrien spielt; EGFR, ein wichtiger Akteur in der onkogenen Transformation; und Tp53, ein zentrales Gen in der DNA-Schadensreaktion. Neben der zeitlich und bedingt kontrollierten Genbearbeitung besteht ein weiterer Vorteil der Methode darin, dass die Stabilisierung von DD-Cas9 unabhängig von seiner Transkription erfolgt. Diese Eigenschaft ermöglicht die Co-Expression von rückverfolgbaren Markern sowie Rekombinasen, wie der Östrogenrezeptor-abhängigen Rekombinase, CREER,unter dem gleichen Promotor. In dieser Arbeit zeigen wir, wie unsere Methode in vitro erfolgreich eingesetzt werden kann, um beispielsweise das DNA-Replikationsgen RPA3 bedingt anzusprechen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die CRISPR/Cas9-Technologie hat die Fähigkeit zur funktionellen Abfrage von Genomen revolutioniert2. Die Inaktivierung von Genen führt jedoch häufig zu Zellletalität, funktionellen Defiziten und Entwicklungsdefekten, was den Nutzen solcher Ansätze für die Untersuchung von Genfunktionen einschränkt7. Darüber hinaus kann die konstitutive Expression von Cas9 zu Toxizität und der Erzeugung von Off-Target-Effekten führen6. Es wurden verschiedene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den früheren Mitgliedern unseres Labors und Wissenschaftler Serif Senturk für die bisherige Arbeit. Wir danken Danilo Segovia für die kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Studie war möglich und wurde von Swim Across America und dem National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center-Programm unterstützt.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
- Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
- Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
- Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
- Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
- Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
- Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
- Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
- Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
- McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
- Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
- Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
- Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
- Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
- Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
- Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
- Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
- Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
- Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).
