Isolement, culture et induction adipogénique des cellules souches adipeuses originales dérivées de l’adipose de l’adipose de l’adiacisation périortique
Summary
Nous présentons un protocole pour l’isolement, la culture, et l’induction adipogenic des cellules souches adipeuses dérivées de crête neurale (NCADSCs) du tissu adipeux périortique de Wnt-1 Cre-/-; Rosa26RFP / souris. Les NCADSC peuvent être une source facilement accessible d’ADSCs pour la modélisation de l’adipogénèse ou de la lipogenèse in vitro.
Abstract
Une quantité excessive de tissu adipeux entourant les vaisseaux sanguins (tissu adipeux périvasculaire, également connu sous le nom de PVAT) est associée à un risque élevé de maladie cardio-vasculaire. Les ADSC dérivés de différents tissus adipeux présentent des caractéristiques distinctes, et ceux du PVAT n’ont pas été bien caractérisés. Dans une étude récente, nous avons rapporté que quelques ADSCs dans le tissu adipeux périortique d’arc (PAAT) descendent des cellules neurales de crête (NCCs), une population transitoire des cellules migratrices provenant de l’ectoderm.
Dans cet article, nous décrivons un protocole pour isoler les nCCs étiquetés par protéines fluorescentes rouges (PD) de la PAAT de Wnt-1Cre.-; Rosa26RFP / souris et induire leur différenciation adipogénique in vitro. En bref, la fraction vasculaire stromal (SVF) est enzymatiquement dissociée de l’APA, et la DP– crête neurale dérivée ADSCs (NCADSCs) sont isolés par le tri des cellules activées par fluorescence (FACS). Les NCADSC se différencient en adipocytes bruns et blancs, peuvent être cryoconservés et conservent leur potentiel adipogénique pour des passages de 3 à 5. Notre protocole peut générer des ADSC abondants à partir du PVAT pour la modélisation de l’adipogénèse PVAT ou de la lipogenèse in vitro. Ainsi, ces NCADSCs peuvent fournir un système précieux pour étudier les commutateurs moléculaires impliqués dans la différenciation PVAT.
Introduction
La prévalence de l’obésité augmente dans le monde entier, ce qui augmente le risque de maladies chroniques connexes, y compris les maladies cardiovasculaires et le diabète1. PVAT entoure les vaisseaux sanguins et est une source majeure de facteurs endocriniens et paracrines impliqués dans la fonction de la vascularisation. Les études cliniques montrent que la teneur élevée en PVAT est un facteur de risque indépendant de la maladie cardio-vasculaire2,3, et sa fonction pathologique dépend du phénotype des cellules souches dérivées de l’adipose constituante (ADSCs)4.
Bien que les lignées cellulaires DaDSC comme la murine 3T3-L1, 3T3-F442A, et OP9 soient des modèles cellulaires utiles pour étudier l’adipogenèse ou la lipogenèse5, les mécanismes de régulation de l’adipogenèse diffèrent entre les lignées cellulaires et les cellules primaires. Les ADSC dans la fraction de cellules vasculaires stromal (SVF) isolées directement des tissus adipeux et induites pour se différencier en adipocytes récapitulent probablement l’adipogenèse in vivo et la lipogenèse6. Cependant, la fragilité, la flottabilité et les variations de taille et d’immunophénotypes des ADSC rendent leur isolement direct difficile. En outre, les différentes procédures d’isolement peuvent également affecter de manière significative le phénotype et la capacité potentielle adipogénique de ces cellules7,soulignant ainsi la nécessité d’un protocole qui maintient l’intégrité d’ADSC.
Le tissu adipeux est typiquement classifié comme tissu d’adipeux blanc morphologiquement et fonctionnellement distinct (WAT), ou le tissu adipeux brun (BAT)8, qui abrite des ADSC distincts9. Tandis que les ADSC isolés des WATs sous-cutanés périgonadalets et inguinals ont été caractérisés dans les études précédentes9,10,11,12, moins est connu concernant les ADSC s’agit de PVAT qui est principalement composé de BAT13.
Dans une étude récente, nous avons constaté qu’une partie des ADSC résidents dans le tissu adipeux périortique d’arc (PAAT) sont dérivés des cellules neurales de crête (NCCs), une population transitoire des cellules progénitrices migratoires qui proviennent de l’ectoderm14,15. Des souris transgéniques de Wnt1-Cre ont été employées pour tracer le développement neural de cellules de crête16,17. Nous avons traversé wnt1-Cre– souris avec Rosa26RFP / souris pour générer Wnt-1 Cre– ; Rosa26RFP / Souris, dans lequel les CNC et leurs descendants sont étiquetés avec des protéines fluorescentes rouges (DP) et sont facilement suivis in vivo et in vitro15. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler la crête neurale dérivée aDSCs (NC-dérivé ADSCs, ou NCADSCs) de la souris PAAT et induire les NCADSCs pour se différencier en adipocytes blancs ou adipocytes bruns.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous présentons une méthode fiable pour l’isolement, la culture et l’induction adipogénique des NCADSC extraits du PVAT de Wnt-1Cre. Rosa26RFP / souris transgéniques conçues pour produire des PDSA. Les rapports précédents montrent qu’il n’y a pas de différence significative dans l’expression des marqueurs mésenchymal sénogènes (MSC) généraux dans les NCADSCets et non NCADSCs22, et que les NCADSCont ont un fort potentiel de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Key R-D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), et Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17411971000, 17140902402) ont fourni les fonds pour cette étude .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
