בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז
Summary
אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד, התרבות, והאינדוקציה האדיגנית של הרכס העצבי (NCADSCs) מתוך רקמת השומן של ה-Wnt-1 יצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים. NCADSCs יכול להיות מקור נגיש בקלות של ADSCs עבור מידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה ב מבחנה.
Abstract
כמות מוגזמת של רקמת אדיפוז מסביב לכלי הדם (רקמת השומן הפריקולרית, המוכרת גם כ-PVAT), קשורה לסיכון גבוה למחלות לב וכלי דם. ADSCs שמקורם ברקמות שונות מציגות תכונות נפרדות, ואלה מ-PVAT מ לא התאפיין היטב. במחקר שנערך לאחרונה, דיווחו כי חלק ADSCs ברקמת השומן של האבי העורקים (PAAT) לרדת מן התאים ציצה עצבית (NCCs ‘), אוכלוסייה ארעית של תאים נודדים שמקורם האקטועור.
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור בידוד חלבון פלורסנט אדום (RFP) מתויג NCCs מ PAAT של Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים וגרימת בידול האדיגניים שלהם בתוך מבחנה. בקצרה, שבר כלי הדם סטרומה (SVF) הוא הושעה אנזימטי של PAAT, ו-RFP+ ציצה עצבית הנגזרת ADSCs (NCADSCs) מבודדים על ידי מיון תא המופעל על ידי הזריחה (facs). NCADSCs להבדיל לתוך שניהם adipocytes חום ולבן, יכול להיות cryopreserved, ולשמור על פוטנציאל האדיגניים שלהם עבור ~ 3 – 5 מעברים. הפרוטוקול שלנו יכול ליצור ADSCs שופע מתוך PVAT ל עבור דוגמנות PVAT ע או ליפוגנזה בתוך מבחנה. לפיכך, NCADSCs אלה יכולים לספק מערכת רבת-ערך לחקר המתגים המולקולריים המעורבים בבידול PVAT מ.
Introduction
השכיחות של השמנת יתר היא גוברת ברחבי העולם, אשר מגביר את הסיכון של מחלות כרוניות קשורות, כולל מחלות לב וכלי דם, סוכרת1. PVAT מ המקיף כלי דם הוא מקור עיקרי של גורמים האנדוקריניים האנדוקרינית המעורבים בפונקציה vascuלטורה. מחקרים קליניים מראים כי תוכן ה-pvat הגבוה הוא גורם סיכון עצמאי של מחלות לב וכלי דם2,3, והפונקציה הפתולוגית שלו תלויה בפנוטיפ של בתאי הגזע שנגזר האדיפוז (ADSCs)4.
למרות הקווים של התאים ADSC כמו murine 3T3-L1, 3T3-F442A, ו OP9 הם מודלים סלולריים שימושיים כדי ללמוד adipogenesis או ליפוגנזה5, מנגנוני הרגולציה של אדיפוגנזה שונים בין קווי התא תאים ראשוניים. ADSCs ב סטרומה תא כלי דם (SVF) מבודד ישירות מרקמות אדיפוז והמושרה להבדיל לתוך adipocytes סביר להניח ביותר בשנת vivo אדיפוגנזה וליפוגנזה6. עם זאת, שבריאת, ציפה, ואת הווריאציות גודל וimmunophenotypes של ADSCs להפוך את הבידוד הישיר שלהם מאתגרת. בנוסף, הליכי הבידוד השונים יכולים גם להשפיע באופן משמעותי על היכולת הפוטנציאלית שלהתאים האלה, ובכךמדגישים את הצורך בפרוטוקול השומר על תקינות adsc.
רקמת אדיפוז מסווגת בדרך כלל כרקמת השומן הלבנה המורפולוגית והפונקציונלית (וואט), או רקמת השומן החום (BAT)8, אשר מנמלים בנפרד ADSCs9. בעוד ADSCs בודד מן הואגונאדאל ומוואטים תת עורית התאפיין במחקרים קודמים9,10,11,12, פחות ידוע לגבי ADSCs מ-pvat כי מורכב בעיקר מבת13.
במחקר שנערך לאחרונה, מצאנו שחלק מADSCs התושב ברקמת השומן של אבי העורקים (paat) נגזרים מתאי ציצה עצבית (nccs ק), אוכלוסייה ארעית של תאים של מהגרים מהגרים שמקורם בעור של14,15. Wnt1-עכברים טרנסגניים שימשו למעקב של מעקב העצבים העצבי תא16,17. חצינו Wnt1-היצורים+ עכברים עם Rosa26rfp/+ עכברים ליצור Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26rfp/+ עכברים, שבו nccs ו צאצאיהם מסומנים עם חלבון פלורסנט אדום (rfp) ומסומנים בקלות בvivo ובמבחנה15. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד ציצה עצבית הנגזרת ADSCs (NC-נגזר ADSCs, או NCADSCs) מהעכבר PAAT ולגרום NCADSCs להבדיל לתוך adipocytes לבן או adipocytes חום.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו מציגים שיטה אמינה לבידוד, תרבות, ואינדוקציה אדיפוגניים של NCADSCs שחולצו מ-PVAT של Wnt-1 היצורים+/-; עכברים Rosa26rfp/+ טרנסגניים שתוכננו לייצר rfp+ ADSCs. הדיווחים הקודמים מראים כי אין הבדל משמעותי בביטוי של תאי גזע mesenchymal כללי רב עוצמה (MSCs) סמנים ב NCADSCs ו לא NCADSCs22, ו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
לאומי מפתח R & D תוכנית של סין (2018YFC1312504), הלאומית המדע הטבעי הקרן של סין (81970378, 81670360, 81870293), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי (17411971000, 17140902402) סיפק את הכספים עבור מחקר זה .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
