Isolering, kultur och adipogenic Induktion av neurala Crest Original Fett-Härledda stamceller från periaorektisk fettvävnad
Summary
Vi presenterar ett protokoll för isolering, kultur och adipogenic induktion av neurala crest härledda fett-härledda stamceller (NCADSCs) från periaortic fettvävnad wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss. NCADSCs kan vara en lättillgänglig källa till ADSCs för modellering adipogenesis eller lipogenesis in vitro.
Abstract
En överdriven mängd fettvävnad som omger blodkärlen (perikulär fettvävnad, även känd som PVAT) är associerad med en hög risk för hjärt-kärlsjukdom. ADSCs som härrör från olika fettvävnader visar olika funktioner, och de från PVAT har inte varit väl karakteriserade. I en färsk studie rapporterade vi att vissa ADSCs i periaortic arch fettvävnad (PAAT) härstammar från neurala crest celler (NCCs), en övergående population av flyttande celler som härrör från ektoderm.
I detta dokument beskriver vi ett protokoll för isolerande rött fluorescerande protein (RFP)-märkta NCCs från PAAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss och inducerande deras adipogena differentiering in vitro. Kort är stromal vaskulär fraktion (SVF) enzymatically separeras från PAAT, och RFP+ neurala crest härledda ADSCs (NCADSCs) är isolerade av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). NCADSCs skiljer sig åt både bruna och vita adipocyter, kan kryobevaras, och behålla sin adipogenic potential för ~ 3-5 passager. Vårt protokoll kan generera rikliga ADSCs från PVAT för modellering PVAT adipogenesis eller lipogenesis in vitro. Således kan dessa NCADSCs ge ett värdefullt system för att studera de molekylära växlar som deltar i PVAT differentiering.
Introduction
Förekomsten av fetma ökar över hela världen, vilket ökar risken för relaterade kroniska sjukdomar, inklusive hjärt-kärlsjukdom och diabetes1. PVAT omger blodkärl och är en viktig källa till endokrina och paracrine faktorer som deltar i vaskulatur funktion. Kliniska studier visar att hög PVAT-innehåll är en oberoende riskfaktor för hjärt-kärlsjukdom2,3, och dess patologiska funktion beror på fenotypen av den konstituerande fetthärledda stamceller (ADSCs)4.
Även ADSC cellinjer som murine 3T3-L1, 3T3-F442A och OP9 är användbara cellulära modeller för att studera adipogenesis eller lipogenesis5, reglerande mekanismer för adipogenesis skiljer sig mellan cellinjer och primära celler. ADSCs i stromal vaskulär cell fraktion (SVF) isolerade direkt från fettvävnad och inducerad att skilja till adipocyter troligen rekapitulate in vivo adipogenesis och lipogenesis6. Men bräcklighet, flytkraft, och variationer i storlek och immunophenotypes av ADSCs gör deras direkta isolering utmanande. Dessutom kan de olika isoleringsförfarandena också avsevärt påverka fenotyp och adipogen adrisk adrisk adriska potentiella förmåga för dessa celler7, vilket betonar behovet av ett protokoll som upprätthåller ADSC integritet.
Fettvävnad klassificeras vanligtvis som antingen morfologiskt och funktionellt distinkt vit fettvävnad (WAT), eller den bruna fettvävnaden (BAT)8, som hyser olika ADSCs9. Medan ADSCs isolerade från perigonadal och inguinal subkutana WATs har karakteriserats i tidigare studier9,10,11,12, mindre är känt när det gäller ADSCs från PVAT som huvudsakligen består av BAT13.
I en färsk studie fann vi att en del av de bosatta ADSCs i periaortic arch fettvävnad (PAAT) härrör från neurala crest celler (NCCs), en övergående population av flyttande stamceller som kommer från ektoderm14,15. Wnt1-Cre transgena möss användes för att spåra neurala crest cell utveckling16,17. Vi korsade Wnt1-Cre+ möss med Rosa26RFP /+ möss för att generera Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss, där NCCs och deras ättlingar är märkta med rött fluorescerande protein (RFP) och är lätt spåras in vivo och in vitro15. Här beskriver vi en metod för att isolera neurala crest härledda ADSCs (NC-härledda ADSCs, eller NCADSCs) från musen PAAT och förmå NCADSCs att skilja sig till vita adipocyter eller bruna adipocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie presenterar vi en tillförlitlig metod för isolering, kultur och adipogenic induktion av NCADSCs utvinns ur PVAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgena möss som är utformade för att producera RFP+ ADSCs. Tidigare rapporter visar att det inte finns någon signifikant skillnad i uttrycket av allmänna multipotenta mesenchymal stamceller (MSCs) markörer i NCADSCs och icke NCADSCs22, och att NCADSCs har en stark potential att skilja till adipocyter …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Key FoU Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293) och Vetenskaps- och teknikkommissionen i Shanghai kommun (17411971000, 17140902402) tillhandahöll medlen för denna studie .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
