Periaortik Yağ Dokusundan Nöral Adipoz-Türetilmiş Kök Hücrelerin İzolasyon, Kültür ve Adipojenik İndüksiyonu
Summary
Wnt-1 Cre+/-periaortik yağ dokusundan elde edilen adipoz türetilmiş kök hücrelerin (NCADSCs) izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için bir protokol salıyoruz. Rosa26RFP/+ fareler. NCADSCs in vitro adipogenez veya lipogenez modelleme için ADSCs kolay erişilebilir bir kaynak olabilir.
Abstract
Kan damarlarını çevreleyen yağ dokusunun aşırı miktarda (perivasküler yağ dokusu, ayrıca PVAT olarak da bilinir) kardiyovasküler hastalık riski ile ilişkilidir. Farklı yağ dokularından elde edilen ADSC’ler farklı özellikler gösterir ve PVAT’tan elde edilenler iyi karakterize edilmemiştir. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, periaortik ark yağ dokusundaki bazı ADSC’lerin (PAAT) ektodermden kaynaklanan geçici bir göçmen hücre popülasyonu olan nöral krest hücrelerinden (NJKs) indiğini bildirdik.
Bu yazıda, wnt-1 Cre+/-PAAT kırmızı floresan protein (RFP) etiketli NCCs izole etmek için bir protokol açıklar; Rosa26RFP/+ fareler ve in vitro onların adipojenik farklılaşma indükleyen. Kısaca, stromal vasküler fraksiyonu (SVF) enzimatik OLARAK PAAT’tan ayrıştırılır ve RFP+ nöral krest türetilen ADSC’ler (NCADSCs) floresan aktif hücre ayrıştırma (FACS) tarafından izole edilir. NCADSCs kahverengi ve beyaz adipositler hem de ayırt, cryopreserved olabilir, ve ~ 3-5 pasajlar için adipojenik potansiyelini korumak. Protokolümüz, PVAT adipogenez veya lipogenezin in vitro modelini almak için PVAT’tan bol miktarda ADSC üretebilir. Böylece, bu NCADSCs PVAT farklılaşma dahil moleküler anahtarları incelemek için değerli bir sistem sağlayabilir.
Introduction
Obezite prevalansı dünya çapında artmaktadır, hangi kardiyovasküler hastalık ve diyabet de dahil olmak üzere ilgili kronik hastalıkların riskini artırır1. PVAT kan damarlarını çevreler ve vaskülatür fonksiyonunda rol oynayan endokrin ve parakrin faktörlerin önemli bir kaynağıdır. Klinik çalışmalar, yüksek PVAT içeriğinin kardiyovasküler hastalık2,3bağımsız bir risk faktörü olduğunu ve patolojik fonksiyonu kurucu yağ türetilmiş kök hücrelerin fenotip bağlıdır göstermektedir (ADSCs)4.
Murine 3T3-L1, 3T3-F442A ve OP9 gibi ADSC hücre hatları adipogenez veya lipogenez5’iincelemek için yararlı hücresel modeller olmasına rağmen, adipogenez için düzenleyici mekanizmalar hücre hatları ile birincil hücreler arasında farklılık gösterir. Stromal vasküler hücre fraksiyonundaki (SVF) ADSK’lar doğrudan yağ dokularından izole edilmiş ve adipositlere ayırt etmek için indüklenen adipositler büyük olasılıkla vivo adipogenez ve lipogenezde recapitulate6. Ancak, kırılganlık, yüzdürme ve ADSC’lerin boyut ve immünofenotiplerindeki farklılıklar doğrudan izolasyonlarını zora sokuyor. Buna ek olarak, farklı izolasyon prosedürleri de önemli ölçüde bu hücrelerin fenotip ve adipojenik potansiyel yeteneğini etkileyebilir7,böylece ADSC bütünlüğünü koruyan bir protokol ihtiyacını vurgulayarak.
Yağ dokusu genellikle morfolojik ve işlevsel olarak farklı beyaz yağ dokusu (WAT) veya kahverengi yağ dokusu (BAT)8olarak sınıflandırılır, hangi farklı ADSCs barındıran9. Perigonadal ve inguinal subkutan WATs izole ADSCs önceki çalışmalarda karakterize edilmiş iken9,10,11,12, daha az ağırlıklı olarak BAT oluşur PVAT gelen ADSCs ile ilgili olarak bilinmektedir13.
Yakın tarihli bir çalışmada, periaortik ark yağ dokusunda yerleşik ADSC’lerin bir kısmının (PAAT) nöral krest hücrelerinden (NCD) türediğini bulduk, ektoderm den kaynaklanan göçmen progenitor hücreleringeçici bir popülasyon14,15. Wnt1-Cre transgenik fareler nöral krest hücre gelişimini izlemek için kullanılmıştır16,17. Biz Wnt-1 Cre+/-oluşturmak için Rosa26RFP / + fareler ile Wnt1-Cre+ fareler geçti; Rosa26RFP / + fareler, hangi NCCs ve onların torunları kırmızı floresan protein (RFP) ile etiketlenir ve kolayca in vivo ve in vitro15izlenir . Burada, fare PAAT’tan nöral krest türetilmiş ADSC’leri (NC türetilmiş ADSC’ler veya NCADSC’ler) yalıtmak için bir yöntem açıklıyoruz ve NCADSC’leri beyaz adipositler veya kahverengi adipositler olarak ayırt etmeye ikna ediyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada Wnt-1 Cre+/-PVAT’ından çıkarılan NCADSC’lerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için güvenilir bir yöntem sayılmaktadır. RFP+ ADSC üretmek için tasarlanmış Rosa26RFP/+ transgenik fareler. Önceki raporlar, NCADSCs ve non NCADSCs22genel multipotent mezenkimal kök hücre (MSCs) belirteçlerinin ekspresyonunda anlamlı bir fark olmadığını ve NCADSCs in vitro15,22</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2018YFC1312504), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81970378, 81670360, 81870293) ve Şangay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (174119710000, 17140902402) bu çalışmanın fonlarını sağladı. .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
