Vi presenterar ett protokoll för isolering, kultur och adipogenic induktion av neurala crest härledda fett-härledda stamceller (NCADSCs) från periaortic fettvävnad wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss. NCADSCs kan vara en lättillgänglig källa till ADSCs för modellering adipogenesis eller lipogenesis in vitro.
En överdriven mängd fettvävnad som omger blodkärlen (perikulär fettvävnad, även känd som PVAT) är associerad med en hög risk för hjärt-kärlsjukdom. ADSCs som härrör från olika fettvävnader visar olika funktioner, och de från PVAT har inte varit väl karakteriserade. I en färsk studie rapporterade vi att vissa ADSCs i periaortic arch fettvävnad (PAAT) härstammar från neurala crest celler (NCCs), en övergående population av flyttande celler som härrör från ektoderm.
I detta dokument beskriver vi ett protokoll för isolerande rött fluorescerande protein (RFP)-märkta NCCs från PAAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss och inducerande deras adipogena differentiering in vitro. Kort är stromal vaskulär fraktion (SVF) enzymatically separeras från PAAT, och RFP+ neurala crest härledda ADSCs (NCADSCs) är isolerade av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). NCADSCs skiljer sig åt både bruna och vita adipocyter, kan kryobevaras, och behålla sin adipogenic potential för ~ 3-5 passager. Vårt protokoll kan generera rikliga ADSCs från PVAT för modellering PVAT adipogenesis eller lipogenesis in vitro. Således kan dessa NCADSCs ge ett värdefullt system för att studera de molekylära växlar som deltar i PVAT differentiering.
Förekomsten av fetma ökar över hela världen, vilket ökar risken för relaterade kroniska sjukdomar, inklusive hjärt-kärlsjukdom och diabetes1. PVAT omger blodkärl och är en viktig källa till endokrina och paracrine faktorer som deltar i vaskulatur funktion. Kliniska studier visar att hög PVAT-innehåll är en oberoende riskfaktor för hjärt-kärlsjukdom2,3, och dess patologiska funktion beror på fenotypen av den konstituerande fetthärledda stamceller (ADSCs)4.
Även ADSC cellinjer som murine 3T3-L1, 3T3-F442A och OP9 är användbara cellulära modeller för att studera adipogenesis eller lipogenesis5, reglerande mekanismer för adipogenesis skiljer sig mellan cellinjer och primära celler. ADSCs i stromal vaskulär cell fraktion (SVF) isolerade direkt från fettvävnad och inducerad att skilja till adipocyter troligen rekapitulate in vivo adipogenesis och lipogenesis6. Men bräcklighet, flytkraft, och variationer i storlek och immunophenotypes av ADSCs gör deras direkta isolering utmanande. Dessutom kan de olika isoleringsförfarandena också avsevärt påverka fenotyp och adipogen adrisk adrisk adriska potentiella förmåga för dessa celler7, vilket betonar behovet av ett protokoll som upprätthåller ADSC integritet.
Fettvävnad klassificeras vanligtvis som antingen morfologiskt och funktionellt distinkt vit fettvävnad (WAT), eller den bruna fettvävnaden (BAT)8, som hyser olika ADSCs9. Medan ADSCs isolerade från perigonadal och inguinal subkutana WATs har karakteriserats i tidigare studier9,10,11,12, mindre är känt när det gäller ADSCs från PVAT som huvudsakligen består av BAT13.
I en färsk studie fann vi att en del av de bosatta ADSCs i periaortic arch fettvävnad (PAAT) härrör från neurala crest celler (NCCs), en övergående population av flyttande stamceller som kommer från ektoderm14,15. Wnt1-Cre transgena möss användes för att spåra neurala crest cell utveckling16,17. Vi korsade Wnt1-Cre+ möss med Rosa26RFP /+ möss för att generera Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss, där NCCs och deras ättlingar är märkta med rött fluorescerande protein (RFP) och är lätt spåras in vivo och in vitro15. Här beskriver vi en metod för att isolera neurala crest härledda ADSCs (NC-härledda ADSCs, eller NCADSCs) från musen PAAT och förmå NCADSCs att skilja sig till vita adipocyter eller bruna adipocyter.
I denna studie presenterar vi en tillförlitlig metod för isolering, kultur och adipogenic induktion av NCADSCs utvinns ur PVAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgena möss som är utformade för att producera RFP+ ADSCs. Tidigare rapporter visar att det inte finns någon signifikant skillnad i uttrycket av allmänna multipotenta mesenchymal stamceller (MSCs) markörer i NCADSCs och icke NCADSCs22, och att NCADSCs har en stark potential att skilja till adipocyter …
The authors have nothing to disclose.
National Key FoU Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293) och Vetenskaps- och teknikkommissionen i Shanghai kommun (17411971000, 17140902402) tillhandahöll medlen för denna studie .
4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
HBSS | Gibco | 14025092 | |
HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |