החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות
Summary
הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.
Abstract
נקודה/Icm הפרשת מערכת של הלגיונרים משאבה האלה היא סוג מורכב IV הפרשה מערכת (T4SS) nanomachine כי לאתר את הקוטב החיידקי ו סכסוכי את המסירה של חלבונים ו-DNA מצעים כדי למקד את התאים, תהליך בדרך כלל דורש קשר ישיר תא אל התא. לאחרונה פתרנו את המבנה של מנגנון נקודה/Icm על ידי טומוגרפיה ההקפאה-אלקטרון (ההקפאה) והראו כי הוא יוצר מעטפת תא מפורש ערוץ המתחבר למתחם cytoplasmic. החלת שתי גישות משלימות לשימור המבנה היליד של הדגימה, מיקרוסקופ פלורסנט בתאי החיים וההקפאה, מאפשר ויזואליזציה באתרו של חלבונים והטמעה של הסטואיצ’ימטריה והעיתוי של ייצור של כל רכיב מחשב ביחס ליחידות אחרות של נקודה/Icm. כדי לחקור את הדרישות עבור מיצוב קוטבי ולאפיין תכונות דינמיות המשויכות T4SS מחשב biogenesis, יש לנו התמזגו הקידוד הגן הירוק של התיקייה הפלואורסצנט חלבון פלורסנט נקודה/Icm ATPase במיקומים מקוריים שלהם על הכרומוזום. השיטה הבאה משלבת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית כמותי של תאים חיים והקפאה-ET כדי לכמת לוקליזציה קוטבית, דינמיקה, ומבנה של חלבונים אלה בתאים חיידקיים שלמים. החלת גישות אלה עבור לימוד הלגיונרים האלה משאבה T4SS היא שימושית לאפיון הפונקציה של מערכת נקודה/Icm והוא יכול להיות מותאם ללמוד מגוון רחב של פתוגנים חיידקיים המשתמשים T4SS או סוגים אחרים של מכלולי הפרשה חיידקיים.
Introduction
הלגיונרים האלה משאבה (L. משאבה), הסוכן הפרוטולוגי של מחלת הלגיונרים, שוכן מאגרי מים מתוקים, שם החיידקים מופצים על ידי הדבקה ושכפול בתוך מימיים שחיה בחינם פרוטותים. ל. משאבה הגורמת להתפרצויות של מחלות בבני אדם כאשר האינהלציה של חיידקים aerosolized ממקורות מים ראויים לשתייה מתרחשת. בתאים נגועים, החתרנות של מסלולים מארחים מאפשר L. משאבה המרחפת כדי לעכב התבגרות endocytic של החללים שבהם הוא שוכן לקדם biogenesis של תא התא התומך שכפול חיידקי. תהליך זה מונע על ידי סוג חיידקי מיוחדות ivb הפרשה (T4BSS) המכונה נקודה/Icm והרפרטואר שלה של מעל 300 “אפקטור” חלבונים כי הם translocated לתוך מארח ציטוסול במהלך הזיהום כדי להקל על מניפולציה של פונקציות סלולריות1,2,3,4,5. מוטציות חסרות נקודה תפקודית/Icm מנגנון להיכשל לספק את העריקים לתוך המחשב המארח ציטוסול, פגומים עבור שכפול תאיים, והם avirulent במודלים של בעלי חיים של מחלה6,7.
זנים חיידקיים רבים פיתחו מכונות רב רכיבי מורכבות ודינמיות מאוד הנדרשות לתהליכי זיהום. אחרים T4BSS כמו מערכת נקודה/Icm חיוניים גם עבור שכפול תאיים של פתוגנים חיידקיים כגון Coxiella בורנתיבי ו ריקטסיאלה grylli. למרות T4BSS הקשורים באבולוצאוסיים מערכות מסוג מערכת ה-DNA, אשר מתווכים העברת דנ א והוא יכול לספק רפרטואר מוגבל של חלבונים אפקטור, מערכת נקודה/Icm יש כמעט פי שניים מרכיבי מחשב ומספק מגוון רחב של מכונות. ככל הנראה, התרחבות זו במספר הרכיבים אפשרה למנגנון הנקודה/Icm להכיל ולשלב בקלות מחדש את האפשרות8,9.
השתמשנו לאחרונה טומוגרפיה אלקטרון-אלקטרונים (ההקפאה) כדי לפתור את המבנה של מנגנון נקודה/Icm באתרו והראה כי זה יוצר תא מעטפה מפורש ערוץ המתחבר למתחם cytoplasmic. ניתוח נוסף עולה כי ציטוסולוג ATPase DotB מקורביו עם מערכת נקודה/Icm בקוטב התא L. משאבה מנועי באמצעות אינטראקציות עם מיקוד. גילינו כי DotB מציג את התנועה ציטוסולג בתאי חיידקי ביותר, המציין כי ATPase זה קיים באוכלוסייה cytosolic דינאמי אך גם מקורביו עם נקודה קוטבית/מתחמי Icm. בנוסף, הקבוצה מהווה הרכבה של הקסאמרס הקשורה למכלול הממברנה הפנימי, והיא מצטרפת לבסיס של מתחם cytoplasmic זה. ההרכבה של מורכבות DotB-לעשות אנרגיה יוצר ערוץ cytoplasmic המנחה את הטרנסלוקציה של מצעים דרך T4SS (איור 1)10.
למרות ההתקדמות האחרונה, מעט ידוע על איך מערכת נקודה/Icm פונקציות ואיך כל חלבון מרכיב ליצור מנגנון פעיל8. חשיפת המעגלים הרגולטורים של הנקודה/Icm T4SS היא בסיסית כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של אינטראקציות מארח הפתוגן. לכן, אנו דנים כיצד להשתמש במיקרוסקופיה תא לחיות והקפאה-ET כדי לזהות ולאפיין את הרכיבים החיוניים L. משאבה האנטי/Icm המערכת מתויגים עם סופר תיקיית gfp (sfgfp). באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית כמותי, לוקליזציה קוטבי של DotB יוגדר ברקע סוג פראי או כאשר מערכת הרביעי סוג מחיקת. מיקרוסקופ הזמן לשגות ישמש לכמת הבדלים בלוקליזציה ודינמיקה בין הנקודה/Icm ציטוסולטים ATPases.
היישום המשולב של שתי גישות משלימות כגון הדמיה חיה ו-ההקפאה מספק יתרון לעומת אחרים במערכות מבחנה. שתי השיטות מבוצעות בתאים שלמים ושומרות על הסביבה הטבעית של T4BSS, ובכך מזעור השיבוש של המבנה היליד במהלך הכנת המדגם. כי יתר הביטוי של חלבונים עלול לפגוע הסטואיצ’ימטריה של מכשיר הפרשת, sfGFP fusions מוחזרים באמצעות allelic exchange לתוך כרומוזום הלגיונרים , כך שכל היתוך מקודד בעותק אחד והביטוי מונע על ידי מקדם אנדוגני. הדמיה של fusions מקודד כרומוסומלית מאפשרת לכמת את רמת החלבון המדויקת המתבטאת בנקודת זמן מוגדרת. ל-“הקפאה” יש גם יתרונות רבים לקביעת מבנה מערכות הפרשה. היתרון הבולט ביותר הוא שדגימות ההקפאה מורכבות מתאי שלמים קפואים הישמרו על מתחמי מקומיים בהקשר של ארכיטקטורת תאים חיידקיים. כתוצאה מכך, ההקפאה עשויה להיות עדיפה על גישות הטיהור הביוכימי, אשר לחלץ מתחמי ממברנה עשוי להתפשט חלבונים היקפיים ממנגנון הליבה או לשנות את המבנה הכללי. בנוסף, תיוג חלבון של עניין עם חלבון מגושם כגון sfGFP מוסיף מסה שניתן לגילוי על-ידי ההקפאה והוא יכול לסייע עם מיפוי subcomplexes שונים של המנגנון נקודה/Icm על המבנה המתקבל על ידי המקפיא-ET.
גישה זו היא כלי רב עוצמה לגילוי מידע מבני על מתחמים רב מולקולריים להרכיב קרום התא חיידקי. הפרשנות של מבנים הובהר באמצעות טכניקות אלה תסייע לשדה להבין כיצד T4BSS רכיבי הפונקציה, מדוע רכיבים רבים כל כך נדרשים לפונקציה, איך הרכיבים אינטראקציה בתוך המתחם הגדול, ומה פונקציות אלה בצע הרכבות משנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
להבהיר את הפונקציות של מערכות הפרשה חיידקית הוא המפתח להבנה מלאה של אינטראקציות מארח הפתוגן. מערכות הפרשה הן מכונות מורכבות שיכולות להזריק חלבונים לתוך תאי מחשב מארחים, ובמקרים מסוימים מקדמים את הקמתה של נישה תת-תאית התומכת בשכפול חיידקי. השיטה הנ ל מספקת כלים חדשים חשובים ללימוד נקודה/Icm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הבירה ו-C.R.R. תמכו ב-NIH (R37AI041699 וR21AI130671). D.P., B.H. ו-J. L תמכו במוסדות הבריאות הלאומיים (R01AI087946 וR01GM107629).
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
- Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Isberg, R. R., O’Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
- Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
- Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires’ Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
- Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
- Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
- Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
- Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
- Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
- Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
- Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
- Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
- Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
- Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
- Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
