Inducerende akut leverskade hos rotter via tetrachlormethan (CCl4)Eksponering gennem et orogastrisk rør
Summary
Denne protokol beskriver en fælles og gennemførlig metode til at fremkalde akut leverskade (ALI) via CCl4 eksponering gennem et orogastrisk rør. Cl4 eksponering inducerer ALI gennem dannelsen af reaktive ilt arter under sin biotransformation i leveren. Denne metode bruges til at analysere patofysiologi af ALI og undersøge forskellige hepatoprotective strategier.
Abstract
Akut leverskade (ALI) spiller en afgørende rolle i udviklingen af leversvigt, som er karakteriseret ved svær leverdysfunktion, herunder komplikationer såsom leverencephalopati og nedsat proteinsyntese. Passende dyremodeller er afgørende for at teste ALI’s mekanisme og patofysiologi og undersøge forskellige hepatobeskyttende strategier. På grund af sin evne til at udføre kemiske transformationer, tetrachlormethan (CCl4)er meget udbredt i leveren til at fremkalde ALI gennem dannelsen af reaktive ilt arter. CCl4 eksponering kan udføres intraperitoneally, ved indånding, eller gennem en nasogastrisk eller orogastrisk rør. Her beskriver vi en gnaver model, hvor ALI er induceret af CCl4 eksponering gennem en orogastrisk rør. Denne metode er billig, let udføres, og har minimal farerisiko. Modellen er meget reproducerbar og kan i vid udstrækning anvendes til at bestemme effekten af potentielle hepatoprotective strategier og vurdere markører for leverskade.
Introduction
Hyppigheden af giftige fornærmelser mod leveren, især på grund af alkohol og stofmisbrug, er stigende. Akut leverskade (ALI) er forbundet med høj dødelighed og har forårsaget kliniske problemer1,2. Giftig skade fører til død signalering veje i leveren, resulterer i hepatocyt apoptose, nekrose, eller pyrofofonis. ALI spiller en afgørende rolle i udviklingen af leversvigt, som er karakteriseret ved svær leverdysfunktion, herunder komplikationer såsom leverencephalopati og nedsat proteinsyntese3,4. Selv om nyere forskning har øget vores viden om de fysiologiske og patologiske ændringer, der ledsager leversvigt, har den ikke helt forklaret de patomolekylære træk, der påvirker mekanismerne i celledød. Desuden, ingen medicin er i øjeblikket til rådighed til at vende den progressive forringelse i ALI patienter. I øjeblikket er den eneste signifikant effektive behandling levertransplantation5,,6.
For at undersøge ALI’s mekanisme og patofysiologi og for at teste forskellige hepatobeskyttende strategier anvendes forskellige dyremodeller til at fremkalde ALI. En foretrukken dyremodel af ALI bør efterligne sygdommens patologiske proces via en pålidelig, valideret, billig og let anvendelig metode. Eksempler på eksperimentelle modeller omfatter hepatotoksiske midler, kirurgiske procedurer såsom hel eller delvis hepatektomi, fuldstændig eller forbigående devaskularisering, og infektiøse procedurer7,8,9. Kendte hepatotoksiske stoffer omfatter galactosamin, acetaminophen, thioacetamid, azoxythan og CCl4. Af disse er CCl4 meget udbredt, selv om det endnu ikke har været godt karakteriseret10,11,12,13.
CCl4 er en organisk farveløs væskeforbindelse med en sød lugt og næsten ingen brændbarhed ved lavere temperaturer. Udsættelse for høje koncentrationer af CCl4 kan forårsage skader på centralnervesystemet, herunder forringelse af lever og nyrer. CCl4 inducerer ALI gennem sin biotransformation i leveren, som danner reaktive iltarter. Dette sker via P450 cytokromenzymet 2E1, der danner en aktiv metabolit og resulterer i celleskader ved makromolekylebinding, forbedring af lipidperoxidation og forstyrrelse af intracellulær calciumhomøostase14. Desuden kan CCl4-modellen bruges til at stimulere astrocytterne på niveau med RNA-syntese15. Dette hepatotoksin er blevet administreret af den intraperitoneale, intraportal, oral, og intragastriske ruter16.
I denne protokol, Vi beskriver4i detaljer CCl 4-induceret ALI hos rotter via en orogastrisk rør. Denne metode inducerer robust og reproducerbar ALI, der kan bruges til at undersøge patogenesen af ALI. Bestemmelse af alvorligheden af leversygdommen overvåges ved måling af serumglutamat-pyruvattransaminase (GPT), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) enzymer og total bilirubin (TB) samt endelig histologisk diagnose ved hæmatoxylin og eosin (H&E) farvede levervæv. Eksponering for CCl4 gennem en intragastrisk adgang giver mulighed for en praktisk, billig, minimalt invasiv metode med minimal risiko for fare.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol, CCl4 bruges som en lever toksin til at fremkalde ALI i rotter. ALI er karakteriseret ved tab af hepatisk parenkym og efterfølgende dysregulering af leverens metaboliske og syntetiske funktioner. Narkotika, vira, toksiner, autoimmune sygdomme, metaboliske sygdomme, og vaskulære lidelser alle fremkalde hepatocyt død, og den efterfølgende inflammatoriske reaktion bidrager til patogenesen af ALI.
Den første fornærmelse mod leveren fører til cytokin produktion, c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne taknemmeligt anerkender Bertha Delgado, Institut for Patologi, Soroka Medical Center, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Ben-Gurion University of the Negev, for hendes hjælp i laboratoriet samt i histologi analyse.
Materials
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma – Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma – Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
- Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
- Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
- Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
- Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
- Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
- Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
- Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
- Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
- van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
- Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
- Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
- Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
- Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
- Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
- Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
- Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
- Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
- Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
- Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
- Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver “function” tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
- Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
- Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).
