تحليل الرئيسيات غير البشرية جزيرة البنكرياس استهلاك الأكسجين
Summary
يوضح هذا البروتوكول القياس الدقيق والقابل للتكرار لاستهلاك الأكسجين في جزر البنكرياس الرئيسية غير البشرية. وتوفر تقنيات تحميل الجزيرة وطلاء الصفيحة المجهرية اطارا لقياس كفاءه التنفس في أنواع أخرى من الخزان المستزرعة.
Abstract
قياس استهلاك الأكسجين في مجموعات كرويه من الخلايا ، مثل الجزر السابقة البنكرياس الجسم الآخر ، تاريخيا كانت صعبه. ونحن نظهر قياس استهلاك جزيرة الأكسجين باستخدام ميكروبلايت 96-بئر مصممه لقياس استهلاك الأكسجين في خزان. في هذا الفحص ، يتم تغليف ألواح المجهرية كروي مع الخلية والانسجه لاصقه في اليوم السابق لفحص. نحن الاستفادة من حجم صغير من الحل لاصقه لتشجيع جزيرة الانضمام إلى الجزء السفلي من البئر فقط. في يوم الفحص, يتم تحميل 15 الجزر مباشره في قاعده كل بئر باستخدام تقنيه التي تضمن الوضع الأمثل للجزر وقياس دقيق لاستهلاك الأكسجين. يتم البحث في جوانب مختلفه من التنفس الميتوكوندريا دوائيا في الجزر الرئيسية غير البشرية, بما في ذلك التنفس المعتمد علي ATP, التنفس القصوى, وتسرب البروتون. هذا الأسلوب يسمح لنتائج متسقة وقابله للتكرار باستخدام عدد قليل من الجزر الصغيرة لكل بئر. فانه يمكن نظريا ان تطبق علي اي خزان مثقف من حجم مماثل.
Introduction
من أجل الحفاظ علي مستويات الجلوكوز في الدم العادية ، يجب ان تستشعر الخلية β البنكرياس الارتفاعات في الجلوكوز وتفرز الانسولين وفقا لذلك. يرتبط اقتران إفراز الانسولين مع مستويات الجلوكوز مباشره باستقلاب الجلوكوز وإنتاج ATP من خلال فوسفولات الاكسده المتقدريه. وهكذا, الميتوكوندريا تلعب دورا حاسما في تحفيز إفراز اقتران1. تقييم وظيفة الميتوكوندريا خليه β يمكن ان تكشف عن العيوب التي تؤدي إلى ضعف إفراز الانسولين. يتم أيضا ربط إفراز الجلوكاجون بخلايا α البنكرياس بشكل وثيق إلى وظيفة الميتوكوندريا2. علي الرغم من ان خطوط الخلايا جزيرة الخلد قد ثبت مفيده لبعض أنواع الاختبارات ، وعلم وظائف الخلايا من هذه الخلية لا تلخص بدقه وظيفة جزيرة كامله ، كما يتضح من التحفيز من إفراز الانسولين بواسطة جلوكاجون3،4 وتثبيط إفراز جلوخون بالانسولين/سوماتوستاتين5،6 في الجزر الجزيرة سليمه. وهذا يدل علي الحاجة إلى قياس استهلاك الأكسجين باستخدام الجزر كامله وسليمه.
وقد تطورت تقنيات قياس التنفس الخلوي للخلايا الجزيرة بمرور الوقت ، من استخدام الاصباغ الفلورية الحساسة للأكسجين7 إلى أجهزه الاستشعار الصلبة التي تقيس مباشره استهلاك الأكسجين8. صممت في البداية لأحاديه الطبقة ، والخلايا الملتصقة ، والتي يشيع استخدامها أنظمه لوحه ثقافة الخلايا أثبتت انها غير فعاله لجزر البنكرياس. وبما ان الجزر لا تلتزم بشكل طبيعي بالآبار ، فهي عرضه لان يتم دفعها إلى محيط الثقافة مما يؤدي إلى قياس غير دقيق لاستهلاك الأكسجين9. ان يكافح هذا مشكله, يختص [24-ول] لوحات مع هبوط مركزيه ان استطاع احتويت جزائر كان طورت9. ومع ذلك ، فان نظام اللوحات التي تبلغ 24 بئرا كان محدودا بالعدد الكبير من الجزر المطلوبة (50-80 لكل بئر) وعدد الحالات التي يمكن اختبارها في وقت واحد10. وقد تغلبت التطورات الاخيره من الصفائح الدقيقة 96 المصممة خصيصا لتحليل تدفق خارج الخلية في خزان هذه الحواجز ، مما يتيح قياس التنفس جزيرة مع 20 أو اقل من الجزر الصغيرة لكل10جيدا.
هنا ، ونحن نظهر استخدام هذا النظام لقياس استهلاك الأكسجين في الجزر من المكاك اليابانية (المكاك تهيمن) ، وهو نموذج الحيوانية مع البيولوجيا جزيرة مماثله للبشر11،12. في هذا البروتوكول ، يتم تحليل 15 الجزر المكاك لكل بئر. في ايدينا ، 15 الجزر لكل بئر تنتج ارتفاع استهلاك الأكسجين خط الأساس من عدد اقل من الجزر ، مع تنشيط قويه وقمع التنفس استجابه للتلاعب الدوائي. ونحن نسلط الضوء علي الخطوات اللازمة للتحضير لفحص ، وسيله فعاله لتحميل متسقة من الجزر في وسط كل بئر ، والتحديات المشتركة عند تنفيذ هذا الفحص.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أعاقت الدراسة من استهلاك الأكسجين جزيرة في السابق من قبل شكل كروي من الجزر ، وعدم التزام بالأسطح الثقافية ، وعدد الجزر المطلوبة لكل بئر. في هذا البروتوكول ، ونحن تسليط الضوء علي فعاليه 96 كروي microplate لقياس استهلاك الأكسجين جزيرة علي عدد قليل من الجزر الصغيرة وإظهار تقنيه لمناوله وتحميل ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون ان يعترفوا بنواه الفحص العالي الانتاجيه لاستخدام مرافقهم ، والتكنولوجيات الحيوية Agilent ، والدكتور بول Kievit (جامعه اوريغون للصحة والعلوم) لعزل الرئيسيات غير البشرية ، واريك دوناهو (جامعه فانديربيلت) للحصول علي المساعدة في الشكل 1. وقد دعمت J.M.E. من قبل NIGMS من المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة T32GM007347. وقد دعمت M.G. من قبل المعاهد القومية للصحة/NIDDK (R24DK090964) وأداره شؤون قدامي المحاربين (BX003744).
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D’Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- . Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide Available from: https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019)
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP’s ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).
