Analyse van niet-menselijke Primate pancreatic eilandje zuurstofverbruik
Summary
Dit protocol demonstreert de nauwkeurige en reproduceerbare meting van het zuurstofverbruik in niet-humane primaat alvleesklier eilandjes. De laad technieken van het eilandje en de coating van de microplaat bieden een kader voor een efficiënte meting van de ademhaling in andere soorten gekweekte spheroids.
Abstract
De meting van het zuurstofverbruik in spheroid-clusters van cellen, zoals ex-vivo pancreas eilandjes, is van oudsher een uitdaging geweest. We demonstreren de meting van het zuurstofverbruik op het eilandje met behulp van een 96-well microplaat die is ontworpen voor het meten van het zuurstofverbruik in spheroids. In deze test worden spheroid-microplaten op de dag voorafgaand aan de test gecoat met een cel-en weefsellijm. We gebruiken een kleine hoeveelheid lijm oplossing om de hechting van het eilandje aan te moedigen tot alleen de bodem van de put. Op de dag van de assay worden 15 eilandjes direct in de basis van elke put geladen met behulp van een techniek die zorgt voor een optimale positionering van eilandjes en een nauwkeurige meting van het zuurstofverbruik. Verschillende aspecten van de mitochondriale ademhaling zijn geprobed farmacologisch in niet-menselijke primaten eilandjes, met inbegrip van ATP-afhankelijke ademhaling, maximale ademhaling, en Proton lek. Deze methode maakt consistente, reproduceerbare resultaten mogelijk met slechts een klein aantal eilandjes per put. Het kan theoretisch worden toegepast op elke gekweekte sferoïden van vergelijkbare grootte.
Introduction
Om de normale bloedglucosespiegels te handhaven, moet de cel alvleesklier β een verhoging in glucose voelen en insuline dienovereenkomstig afscheiden. De koppeling van insuline secretie met glucoseniveaus is direct gekoppeld aan glucose metabolisme en de productie van ATP via Mitochondriale oxidatieve fosforylering. Dus, mitochondriën spelen een cruciale rol in stimulus-secretie koppeling1. Beoordeling van β-cel mitochondriale functie kan defecten die leiden tot verminderde insuline secretie onthullen. De secretie van glucagon door pancreas α-cellen is ook nauw verbonden met de mitochondriale functie2. Hoewel vereeuwigd eilandje-cellijnen nuttig zijn gebleken voor sommige soorten assays, geeft de Fysiologie van deze cellen niet nauwkeurig de hele eiland functie weer, zoals geïllustreerd door de potentiëring van de insuline secretie door glucagon3,4 en de remming van de glucagonsecretie door insuline/Somatostatine5,6 in intacte eilandjes. Dit toont aan dat het zuurstofverbruik moet worden gemeten met behulp van hele, intacte eilandjes.
Technieken voor het meten van eilandje Cell respirometrie zijn geëvolueerd in de loop van de tijd, van het gebruik van zuurstof gevoelige fluorescerende kleurstoffen7 tot Solid-State sensoren die direct meten van het zuurstofverbruik8. In eerste instantie ontworpen voor monolayer, aanhandige cellen, veelgebruikte cel cultuur plaat systemen hebben bewezen ondoeltreffend te zijn voor pancreas eilandjes. Omdat eilandjes niet van nature aan de putjes hechten, zijn ze gevoelig voor geduwd naar de periferie van de cultuur, wat resulteert in onnauwkeurige meting van zuurstofverbruik9. Om dit probleem te bestrijden, gespecialiseerde 24-put platen met een centrale depressie die kon bevatten eilandjes werden ontwikkeld9. Het 24-goed plaat systeem werd echter beperkt door het grote aantal vereiste eilandjes (50-80 per put) en het aantal voorwaarden dat tegelijkertijd getest kon worden10. De recente ontwikkeling van 96-well microplaten speciaal ontworpen voor extracellulaire flux analyse in sferoïden heeft deze barrières overwonnen, waardoor de meting van het eilandje respirometrie met 20 of minder eilandjes per put10.
Hier demonstreren we het gebruik van dit systeem voor het meten van het zuurstofverbruik in eilandjes van de Japanse makaak (Macaca fuscata), een diermodel met vergelijkbare eilandje-biologie voor mensen11,12. In dit protocol worden 15 makaak-eilandjes per put geanalyseerd. In onze handen, 15 eilandjes per goed geproduceerd hogere Baseline zuurstofverbruik dan minder eilandjes, met robuuste activering en onderdrukking van de ademhaling in reactie op de farmacologisch manipulatie. We benadrukken de stappen om voor te bereiden op de Assay, een effectieve methode voor het consistent laden van eilandjes in het midden van elke put, en gemeenschappelijke uitdagingen bij het uitvoeren van deze test.
Protocol
Representative Results
Discussion
De studie van het zuurstofverbruik in het eiland is eerder belemmerd door de bolvormige vorm van eilandjes, hun gebrek aan naleving van cultuur oppervlakken en het aantal vereiste eilandjes per put. In dit protocol benadrukken we de werkzaamheid van de 96-well spheroid-microplaat voor het meten van het zuurstofverbruik op het eilandje op een klein aantal eilandjes en demonstreren we een techniek voor het hanteren en laden van eilandjes die technisch haalbaar is en consistente Resultaten.
Om te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de Vanderbilt High throughput screening core voor het gebruik van hun faciliteiten, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) voor niet-menselijke primaten-eilandje-isolaties en Eric Donahue (Vanderbilt University) voor hulp bij figuur 1, erkennen. J.M.E. werd gesteund door NIGMS van de National Institutes of Health onder het awardnummer T32GM007347. M.G. werd gesteund door de NIH/NIDDK (R24DK090964-06) en het departement Veterans Affairs (BX003744).
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D’Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- . Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide Available from: https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019)
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP’s ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).
