非ヒト霊長類膵島酸素消費量の分析
Summary
このプロトコルは、非ヒト霊長類膵島における酸素消費量の正確かつ再現性の測定を示す。マイクロプレートの小口ローディング技術およびコーティングは、他のタイプの培養スフェロイドにおける呼吸の効率的な測定のためのフレームワークを提供する。
Abstract
ex vivo膵島のような細胞の回転楕円体クラスターにおける酸素消費量の測定は、歴史的に困難でした。回転楕円体中の酸素消費量の測定用に設計された96ウェルマイクロプレートを用いて、小本当座酸素消費量の測定を実証する。このアッセイでは、回転楕円体マイクロプレートは、アッセイの前日に細胞および組織接着剤でコーティングされる。少量の接着剤溶液を利用して、井戸の底だけに対するイツラシの付着を促します。アッセイの日に、15個の小島が各井戸のベースに直接積み込まれ、小島の最適な位置決めと酸素消費量の正確な測定を保証する技術を使用します。ミトコンドリア呼吸の様々な側面は、ATP依存性呼吸、最大呼吸、およびプロトン漏出を含む非ヒト霊長類の島で薬理学的にプローブされる。この方法では、井戸あたりの小島の数が少ないだけで、一貫性のある再現可能な結果が得られます。理論的には、同様のサイズの任意の培養回転楕円体に適用することができる。
Introduction
正常な血糖値を維持するために、膵臓β細胞はグルコースの上昇を感知し、それに応じてインスリンを分泌しなければならない。グルコースレベルとインスリン分泌の結合は、グルコース代謝とミトコンドリア酸化リン酸化リン酸化を介してATPの産生に直接リンクされています。従って、ミトコンドリアは刺激分泌結合1において重要な役割を果たす。β細胞ミトコンドリア機能を評価すると、インスリン分泌障害につながる欠陥を明らかにすることができます。膵臓α細胞によるグルカゴンの分泌もミトコンドリア機能2と密接に結びついている。不死化した島の細胞株は、いくつかのタイプのアッセイに有用であることが証明されているが、これらの細胞の生理学は、グルカゴン3、4およびインスリン/ソマトスタチン5、6無傷のイレットによるインスリン分泌の増強によって示すように、全島機能を正確に再現しない。これは、完全な、無傷の小島を使用して酸素消費量を測定する必要性を示しています。
アイソレ細胞の呼吸法の測定技術は、酸素感受性蛍光色素7の使用から酸素消費量を直接測定する固体センサまで、時間の経過とともに進化してきた。当初は単層、付着細胞、一般的に使用される細胞培養プレートシステム用に設計されており、膵島には効果がないことが証明されている。小島は自然に井戸に付着しないので、それらはよく酸素消費量9の不正確な測定をもたらす培養の周辺に押し込まれる傾向がある。この問題に対処するために、小島を含むことができる中央うつ病を持つ特殊な24ウェルプレートが開発されました9.しかし、24ウェルプレートシステムは、必要な多数の小島(井戸あたり50〜80)と同時にテストできる条件の数によって制限された。スフェロイドの細胞外フラックス解析のために特別に設計された96ウェルマイクロプレートの最近の開発は、これらの障壁を克服し、井戸10あたり20以下の小島で島の呼吸の測定を可能にする。
ここでは、ヒト11、12に類似した島の生物学を持つ動物モデルであるニホンザル(マカカフスカタ)からの島の酸素消費量を測定するためにこのシステムの使用を実証する。このプロトコルでは、15個のマカク島がウェルごとに分析されます。私たちの手では、15の島は、より少ない島よりも高いベースライン酸素消費量を生産し、薬理学的操作に応答して呼吸の堅牢な活性化と抑制を行いました。アッセイに備えるステップ、各井戸の中心に島を一貫して積み込むための効果的な方法、およびこのアッセイを行う際の一般的な課題を強調します。
Protocol
Representative Results
Discussion
島の酸素消費量の研究は、以前、島の球形の形状、培養面への付着の欠如、および井戸あたりの必要な島の数によって妨げられてきた。このプロトコルでは、少数の小島の島の酸素消費量を測定するための96ウェルスフェロイドマイクロプレートの有効性を強調し、技術的に実現可能で一貫した島を処理し、ロードする技術を実証します。結果。
小島がマイクロプレート…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、彼らの施設の使用のためのヴァンダービルトハイスループットスクリーニングコア、アジレントバイオテクノロジー、非ヒト霊長類のイサット分離のためのポール・キエフ博士(オレゴン健康科学大学)、および図1の支援のためのエリック・ドナヒュー(ヴァンダービルト大学)を認めたい。J.M.E.は、国立衛生研究所のNIGMSによって、受賞番号T32GM007347の下でサポートされました。M.G.は、NIH/NIDDK(R24DK090964-06)と退役軍人省(BX003744)の支援を受けました。
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
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