Анализ нечеловеческого примата поджелудочной железы на идокол потребление кислорода
Summary
Этот протокол демонстрирует точное и воспроизводимое измерение потребления кислорода в нечеловеческих островках поджелудочной железы приматов. Методы загрузки на аклетии и покрытие микроплиты обеспечивают основу для эффективного измерения дыхания в других типах культивированных сфероидов.
Abstract
Измерение потребления кислорода в сфероидных кластерах клеток, таких как островки поджелудочной железы ex vivo, исторически было сложным. Мы демонстрируем измерение потребления кислорода с помощью 96-лукосновейной микроплиты, предназначенной для измерения потребления кислорода в сфероидах. В этом анализе, сфероидные микроплиты покрыты клеткой и клей ткани на день до начала асссе. Мы используем небольшой объем клеевого раствора, чтобы стимулировать присоединение к аботам только в нижней части скважины. В день проведения асссея 15 островков загружаются непосредственно в основание каждой скважины с помощью техники, обеспечивающей оптимальное позиционирование островков и точное измерение потребления кислорода. Различные аспекты митохондриального дыхания исследуются фармакологически в нечеловеческих островках приматов, включая аТПл-зависимое дыхание, максимальное дыхание и протонную утечку. Этот метод позволяет для последовательных, воспроизводимых результатов, используя только небольшое количество островков на скважину. Теоретически его можно применять к любым культурным сфероидам аналогичного размера.
Introduction
Для того, чтобы поддерживать нормальный уровень глюкозы в крови, поджелудочная клетка должна чувствовать возвышения в глюкозе и выделять инсулин соответственно. Связь секреции инсулина с уровнем глюкозы напрямую связана с метаболизмом глюкозы и выработкой АТФ через митохондриальную окислительное фосфорилирование. Таким образом, митохондрии играют важную роль в стимул-секретии связи1. Оценка митохондриальной функции клеток может выявить дефекты, которые приводят к нарушению секреции инсулина. Секреция глюкагона клетками поджелудочной железы также тесно связана с митохондриальной функцией2. Хотя увековеченные линии островковых клеток оказались полезными для некоторых типов анализов, физиология этих клеток не точно резюмировать функцию целых островков, как показано на потенцировании секреции инсулина глюкагоном3,4 и ингибирование секреции глюкагона инсулином/соматостатином5,6 в нетронутых островках. Это свидетельствует о необходимости измерения потребления кислорода с помощью целых, нетронутых островков.
Методы измерения респирометрии клеток на случай развития произошли, начиная с использования чувствительных к кислороду флуоресцентных красителей7 и к твердотельным датчикам, которые непосредственно измеряют потребление кислорода8. Первоначально предназначенные для монослойных, адептов клеток, широко используемых систем клеточной культуры пластины оказались неэффективными для островков поджелудочной железы. Поскольку островки естественным образом не прилипают к скважинам, они склонны к вытеснению на периферию культуры, что приводит к неточному измерению потребления кислорода9. Для борьбы с этой проблемой были разработаны специализированные 24-колодчатые пластины с центральной депрессией, которые могли содержатьостровки. Тем не менее, 24-хорошая система пластины была ограничена большим количеством островков требуется (50-80 на скважину) и количество условий, которые могут быть проверены одновременно10. Недавняя разработка 96-колодчатых микроплит, разработанных специально для внеклеточного анализа потока в сфероидах, преодолела эти барьеры, позволив измерить островок с помощью 20 или меньше островков на10.
Здесь мы демонстрируем использование этой системы для измерения потребления кислорода в островках от японской макаки (Macaca fuscata), модель животных с аналогичной биологией островка для людей11,12. В этом протоколе анализируются 15 островков макаки на скважину. В наших руках, 15 островков на хорошо производится более высокое потребление исходного кислорода, чем меньше островков, с надежной активации и подавления дыхания в ответ на фармакологические манипуляции. Мы выделяем шаги по подготовке к ассею, эффективный метод последовательной загрузки островков в центре каждой скважины, и общие проблемы при выполнении этого асссе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изучение потребления кислорода островка ранее было затруднено сферической формой островков, их несоблюдением культурных поверхностей и количеством островков, необходимых для скважины. В этом протоколе мы подчеркиваем эффективность 96-хорошей сфероидной микроплиты для измерения пот?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить Vanderbilt High Throughput скрининга core для использования их объектов, Agilent биотехнологии, д-р Пол Kievit (Орегон здравоохранения и науки университета) для не-человеческих приматов изысканий приматов, и Эрик Донахью (Университет Вандербильта) за помощь с рисунком 1. J.M.E. была поддержана NIGMS Национальных институтов здравоохранения под номером премии T32GM0007347. М.Г. была поддержана NIH/NIDDK (R24DK090964-06) и Департаментом по делам ветеранов (BX003744).
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D’Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- . Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide Available from: https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019)
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP’s ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).
