Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales
Summary
Aquí, presentamos un método de cribado modificado que se puede utilizar ampliamente para examinar rápidamente los supresores de silenciamiento de ARN en patógenos vegetales.
Abstract
El silenciamiento del ARN es un mecanismo de regulación genética evolutivamente conservado y específico de la secuencia en eucariotas. Varios patógenos vegetales han evolucionado proteínas con la capacidad de inhibir la vía de silenciamiento de ARN de la planta huésped. A diferencia de las proteínas efectoras del virus, sólo varias proteínas efectoras secretas han demostrado la capacidad de suprimir el silenciamiento de ARN en patógenos bacterianos, oomicécetos y fúngicos, y las funciones moleculares de la mayoría de los efectores siguen siendo en gran medida desconocidas. Aquí, describimos en detalle una versión ligeramente modificada del ensayo de coinfiltración que podría servir como un método general para observar el silenciamiento del ARN y para caracterizar las proteínas efectoras secretadas por patógenos vegetales. Los pasos clave del enfoque son elegir las hojas sanas y completamente desarrolladas, ajustar el cultivo de bacterias a la densidad óptica (OD) adecuada a 600 nm, y observar la fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) en el momento óptimo en el infiltrado hojas con el fin de evitar la omisión de efectos con una actividad de supresión débil. Este protocolo mejorado contribuirá a un cribado rápido, preciso y extenso de los supresores de silenciamiento de ARN y servirá como un excelente punto de partida para investigar las funciones moleculares de estas proteínas.
Introduction
En las últimas dos décadas, la aceleración en la secuenciación del genoma de microorganismos que causan enfermedades vegetales ha dado lugar a una brecha de conocimiento cada vez mayor entre la información de secuencia y las funciones biológicas de las proteínas codificadas1. Entre las moléculas reveladas por proyectos de secuenciación se encuentran moléculas efectoras que suprimen la inmunidad innata y facilitan la colonización del huésped; estos factores son secretados por patógenos vegetales destructivos, incluyendo bacterias, nematodos y microbios filamentosos. Para responder a estas amenazas, las plantas anfitrionas han desarrollado nuevos receptores que reconocen a estos efectores, permitiendo la restauración de la respuesta inmune. Por lo tanto, los efectores están sujetos a diversas presiones selectivas, lo que conduce a la diversificación de los repertorios de efectores entre los linajes de patógenos2. En los últimos años, se ha demostrado que los efectores putativos de patógenos vegetales de patógenos vegetales interrumpen la inmunidad innata de las plantas al impedir los procesos celulares del huésped para beneficiar a los microbios de diversas maneras, incluyendo la desregulación de las vías de señalización, transcripción, transporte intracelular, estabilidad del citoesqueleto, tráfico de vesículas y silenciamiento de ARN3,4,5. Sin embargo, la gran mayoría de los efectores patógenos, particularmente los de patógenos filamentosos, han permanecido enigmáticos.
El silenciamiento de ARN es una maquinaria de inactivación genética mediada por homología que se conserva entre los eucariotas. El proceso se desencadena por el ARN de doble cadena (dsRNA) y se dirige al ARN homólogo de una sola cadena (ssRNA) de una manera específica de la secuencia, y manipula una amplia gama de procesos biológicos, incluida la defensa antiviral6. Para superar las respuestas inmunitarias innatas del huésped, algunos virus han evolucionado para compensar el silenciamiento del ARN, incluida la capacidad de replicarse dentro de compartimentos intracelulares o escapar de la señal reorganizada de silenciamiento. Sin embargo, la estrategia más general mediante la cual los virus protegen sus genomas contra la pérdida dependiente del ARN dependiente del silenciamiento de la función génica es codificar proteínas específicas que suprimen el silenciamiento del ARN7,8. Se han establecido varios enfoques mecanicistas diferentes para examinar y caracterizar los supresores virales del silenciamiento de ARN (VSR), incluyendo la coinfiltración de cultivos de Agrobacterium tumefaciens, plantas transgénicas que expresan supresores putativos, injertos y cultivo celular9,10,11,12,13.
Cada uno de estos ensayos tiene ventajas y desventajas, e identifica vsR de su propia manera distinta. Uno de los enfoques más comunes se basa en la co-infiltración de cultivos individuales de A. tmuefaciens que albergan la proteína viral potencial y un gen reportero (típicamente proteína fluorescente verde [GFP]) en las plantas de Nicotiana benthamiana 16c que constituyen la expresión de GFP bajo el control del virus de mosaico de coliflor 35S promotor. En ausencia de un supresor de silenciamiento viral activo, GFP es identificado como exógeno por las células huésped y se silencia dentro de los 3 días después de la infiltración (dpi). Por el contrario, si la proteína viral posee actividad de supresión, el nivel de expresión de GFP se mantiene estable más allá de 3 a 9 ppp9. Este ensayo de co-infiltración es simple y rápido; sin embargo, no es altamente estable ni sensible. No obstante, el ensayo ha identificado numerosos VSR con diversas secuencias y estructuras proteicas en muchos virus de ARN7,8.
Recientemente, varias proteínas efectoras que pueden inhibir la actividad de silenciamiento del ARN celular se han caracterizado por patógenos de plantas bacterianas, oomycete y hongos14,15,16. Estos hallazgos implican que la supresión del silenciamiento del ARN es una estrategia común para facilitar la infección que es utilizada por patógenos en la mayoría de los reinos. En teoría, muchos, si no todos, de los efectores podrían codificar los supresores de silenciamiento de ARN (RSS); hasta la fecha, sin embargo, sólo unos pocos han sido identificados, principalmente debido a la escasez de la estrategia de cribado fiable y general. Además, no se han investigado supresores de silenciamiento de ARN en la gran mayoría de los patógenos vegetales17.
En este informe, presentamos un protocolo optimizado y general para identificar los efectores de patógenos vegetales que pueden suprimir el silenciamiento de ARN local y sistémico utilizando el ensayo de infiltración agroindustrial. El objetivo principal de este estudio fue enfatizar los aspectos clave del protocolo y describir los pasos en detalle, proporcionando así un ensayo de cribado que es adecuado para casi todos los efectores de patógenos vegetales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El silenciamiento de ARN es un mecanismo de defensa clave empleado por las plantas para combatir patógenos virales, bacterianos, oomycete y hongos. A su vez, estos microbios han evolucionado las proteínas supresoras de silenciamiento para contrarrestar el silenciamiento antiviral, y estos RSS interfieren con diferentes pasos de la vía de silenciamiento del ARN22,23. Se han desarrollado varios ensayos de cribado para identificar los RSS10.</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del “Programa Shuguang” de la Fundación para el Desarrollo Educativo de Shanghái y la Comisión Municipal de Educación de Shanghái, el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China Programa Nacional de I+D Clave de China ( 2018YFD0201500), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.o 31571696 y 31660510), el Programa de Mil Talentos para Jóvenes Profesionales de China, y la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái (18DZ2260500).
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
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