식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별
Summary
여기서, 우리는 식물 병원체에서 RNA 침묵 억제제를 신속하게 스크리닝하는 데 광범위하게 사용될 수 있는 변형된 스크리닝 방법을 제시한다.
Abstract
RNA 침묵은 진핵생물에 있는 진화적으로 보존된, 서열 특정 유전자 규칙 기계장치입니다. 몇몇 식물 병원체는 숙주 식물 RNA 침묵 통로를 억제하는 기능을 가진 단백질을 진화했습니다. 바이러스 이펙터 단백질과 는 달리, 단지 몇몇 분비 이펙터 단백질은 세균, 오미세테 및 곰팡이 병원체에서 RNA 침묵을 억제하는 능력을 보여주었으며, 대부분의 이펙터의 분자 기능은 크게 알려지지 않은 채로 남아 있다. 여기서, 우리는 RNA 침묵을 관찰하고 식물 병원체에 의해 분비되는 이펙터 단백질을 특성화하는 일반적인 방법으로 작용할 수 있는 병입 분석법의 약간 변형된 버전을 상세히 기술한다. 접근법의 주요 단계는 건강하고 완전히 발달된 잎을 선택하고, 박테리아 배양을 600 nm에서 적절한 광학 밀도(OD)로 조정하고, 침윤에 대한 최적의 시간에 녹색 형광 단백질(GFP) 형광을 관찰하는 것입니다. 억제 활동이 약한 이펙터를 생략하지 않도록 합니다. 이 향상된 프로토콜은 RNA 침묵 억제제의 신속하고 정확하며 광범위한 스크리닝에 기여하고 이러한 단백질의 분자 기능을 조사하기 위한 훌륭한 출발점역할을 할 것입니다.
Introduction
지난 2년간 식물 질환을 유발하는 미생물의 게놈 염기서열 분석이 가속화되면서 서열 정보와 인코딩된 단백질의 생물학적 기능 사이의 지식 격차가 계속 증가하고 있다1. 시퀀싱 프로젝트에 의해 밝혀진 분자 중에는 선천성 면역을 억제하고 숙주 식민지화를 촉진하는 이펙터 분자가 있습니다. 이 요인은 박테리아, 선충 및 필라멘트 미생물을 포함하여 파괴적인 식물 병원체에 의해 분비됩니다. 이러한 위협에 대응하기 위해 숙주 식물은 이러한 이펙터를 인식하는 새로운 수용체를 진화시켜 면역 반응을 회복시냅니다. 따라서, 이펙터는 병원체 계보 중 이펙터 레퍼토리의 다양화로 이어지는 다양한 선택적 압력의 대상이 된다2. 최근 몇 년 동안, 식물 병원균에서 putative 이펙터는 신호 경로의 dysregulation, 전사, 세포 내 수송, 세포 내 수송, 소포 인신 매매 및 RNA silencing3,4,5를포함하여 다양한 방법으로 미생물에 혜택을 호스트 세포 프로세스를 방해하여 식물 선천적 면역을 방해하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 병원체 이펙터의 대다수, 특히 필라멘트 병원체에서 그, 수수께끼 남아 있다.
RNA 침묵은 진핵생물 사이에서 보존되는 상동성 중재한 유전자 불활성화 기계입니다. 이 과정은 긴 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 의해 트리거되고 상동성 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 서열특이적 방식으로 표적으로 하며, 항바이러스 방어6을포함하는 광범위한 생물학적 과정을 조작한다. 호스트의 타고난 면역 반응을 극복하기 위하여는, 몇몇 바이러스는 세포내 구획 안쪽에 복제하거나 침묵 개편된 신호에서 탈출하는 기능을 포함하여 RNA 침묵을 상쇄하기 위하여 발전했습니다. 그럼에도 불구하고, 바이러스가 유전자 기능의 RNA 침묵 의존적 손실에 대하여 그들의 게놈을 보호하는 가장 일반적인 전략은 RNA 침묵7,8을억제하는 특정 단백질을 인코딩하는 것이다. 아그로박테리움 투메파시엔스 배양, 이식 및 세포 배양 을 발현하는 형질전환 식물의 공동 침투를 포함하여 RNA 침묵(VSRs)의 바이러스 억제제를 스크리닝하고 특성화하기 위해 여러 기계적으로 다른 접근법이 확립되었다9,10,11,12,13.
이러한 각 연구는 장점과 단점을 가지고 있으며, 그 자체로 VSR을 식별합니다. 가장 일반적인 접근법 중 하나는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S의 통제 하에 GFP를 구성하는 니코티아나 벤타미아나 16c 식물에 잠재적인 바이러스 단백질 및 리포터 유전자(전형적으로 녹색 형광 단백질 [GFP])를 품고 있는 개별 A. tmuefaciens 배양물의 공동 침윤에 기초한다. 활성 바이러스 침묵 억제제의 부재에서, GFP는 숙주 세포에 의해 외인성으로 확인되고 침투 후 3일 이내에 침묵된다(dpi). 대조적으로, 바이러스 성 단백질이 억제 활성을 가지고 있다면, GFP의 발현 수준은 3−9 dpi9를넘어 꾸준히 유지됩니다. 이 공동 침투 분석은 간단하고 빠릅니다. 그러나 매우 안정적이지도 않고 민감하지도 않습니다. 그럼에도 불구하고, 분석은 많은 RNA 바이러스7,8에서다양한 단백질 서열 및 구조를 가진 수많은 VSR을 확인하였다.
최근에는 세포RNA 침묵 활성을 억제할 수 있는 여러 가지 이펙터 단백질이 세균, 오미세테 및 곰팡이 식물 병원균14,15,16으로특징지어지고 있다. 이 사실 인정은 RNA 침묵 억제가 대부분의 왕국에 있는 병원체에 의해 이용되는 감염을 촉진하기 위한 일반적인 전략이다는 것을 암시합니다. 이론적으로, 많은, 전부는 아니지만, 이펙터의 RNA 침묵 억제기를 인코딩 할 수있다 (RSSs); 그러나 현재까지 는 신뢰할 수 있고 일반적인 선별 전략의 부족으로 인해 소수의 사람만이 확인되었습니다. 더욱이, RNA 침묵의 억제제는 식물병원체(17)의대다수에서 조사되지 않았다.
이 보고서에서는 농업 침투 분석을 사용하여 국소 및 전신 RNA 침묵을 억제할 수 있는 식물 병원균 이펙터를 식별하기 위한 최적화되고 일반적인 프로토콜을 제시합니다. 이 연구의 가장 중요한 목적은 프로토콜의 주요 측면을 강조하고 단계를 상세히 설명함으로써 식물 병원균의 거의 모든 이펙터에 적합한 스크리닝 분석기를 제공하는 것이었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA 침묵은 바이러스성, 세균성, 난균체 및 곰팡이 병원균에 대처하기 위해 식물에 의해 사용되는 주요 방어 메커니즘입니다. 차례로, 이들 미생물은 항바이러스 침묵을 중화하기 위해 침묵 억제 단백질을 진화시키고, 이들 RSSs는 RNA 침묵 경로22,23의상이한 단계를 방해한다. RSSS10을확인하기 위해 여러 스크리닝 검거가 개발되었습니다.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 상하이 교육개발재단과 상하이시 교육위원회의 “슈광 프로그램”의 보조금으로 지원되었으며, 중국 의 국가 핵심 R&D 프로그램( 2018YFD0201500), 중국 국립자연과학재단(제31571696호 및 31660510호), 중국 청년전문가를 위한 천인재 프로그램, 상하이시 과학기술위원회(18DZ2260500).
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
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