Screening og identifisering av RNA-dempende suppressorer fra utskillede effektorer av plantepatogener

Summary

Her presenterer vi en modifisert screeningmetode som kan brukes mye til raskt å screene RNA-deaktiveringssuppressorer i plantepatogener.

Abstract

RNA-deaktivering er en evolusjonært bevart, sekvensspesifikk genreguleringsmekanisme i eukaryoter. Flere plantepatogener har utviklet proteiner med evnen til å hemme vertsanlegget RNA-deaktiveringsveien. I motsetning til viruseffektorproteiner har bare flere utskillede effektorproteiner vist evnen til å undertrykke RNA-deaktivering i bakteriell, oomycete og sopppatogener, og de molekylære funksjonene til de fleste effektorer forblir i stor grad ukjente. Her beskriver vi i detalj en litt modifisert versjon av koinfiltrasjonsanalysen som kan tjene som en generell metode for å observere RNA-deaktivering og for karakterisering av effektorproteiner utskilt av plantepatogener. De viktigste trinnene i tilnærmingen er å velge de sunne og fullt utviklede bladene, justere bakteriekulturen til riktig optisk tetthet (OD) ved 600 nm, og observere grønt fluorescerende protein (GFP) fluorescens på optimal tid på infiltrert forlater for å unngå å utelate effektorer med svak undertrykkelse aktivitet. Denne forbedrede protokollen vil bidra til rask, nøyaktig og omfattende screening av RNA-deaktiveringssuppressorer og tjene som et utmerket utgangspunkt for å undersøke de molekylære funksjonene til disse proteinene.

Introduction

I løpet av de siste to tiårene har akselerasjon i genomsekvensering av mikroorganismer som forårsaker plantesykdommer ført til et stadig økende kunnskapsgap mellom sekvensinformasjon og de biologiske funksjonene til kodede proteiner¹. Blant molekylene som avsløres av sekvenseringsprosjekter er effektormolekyler som undertrykker medfødt immunitet og letter vertskolonisering; Disse faktorene utskilles av destruktive plantepatogener, inkludert bakterier, nematoder og filamentous mikrober. For å svare på disse truslene har vertsplanter utviklet nye reseptorer som gjenkjenner disse effektene, noe som muliggjør restaurering av immunresponsen. Derfor er effektorer gjenstand for ulike selektive trykk, noe som fører til diversifisering av effekteller repertoarer blant patogene linjer². I de senere årene har antatte effektorer fra plantepatogener vist seg å forstyrre plantemedfødt immunitet ved å hindre vertscellulære prosesser til fordel for mikrobene på en rekke måter, inkludert dysregulering av signalveier, transkripsjon, intracellulær transport, cytoskjelettstabilitet, vesicle trafficking og RNA silencing^3,4,5. Men de aller fleste patogene effektorer, spesielt de fra filamentous patogener, har vært gåtefulle.

RNA-deaktivering er et homologimediert geninaktiveringsmaskiner som bevares blant eukaryoter. Prosessen utløses av lang dobbelt-strandet RNA (dsRNA) og retter seg mot homologen en-strandet RNA (ssRNA) på en sekvens-spesifikk måte, og det manipulerer et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert antiviral forsvar⁶. For å overgå medfødte immunresponser fra verten, har noen virus utviklet seg til å oppveie RNA-deaktivering, inkludert evnen til å replikere inne i intracellulære rom eller flykte fra det omorganiserte signalet. Likevel er den mest generelle strategien der virus beskytter sine genomer mot RNA-deaktiveringsavhengig tap av genfunksjon å kode spesifikke proteiner som undertrykker RNA-deaktivering^7,8. Flere mekanistisk forskjellige tilnærminger har blitt etablert for å screene og karakterisere viralsuppressorer av RNA-deaktivering (VSRs), inkludert samtidig infiltrasjon av Agrobacterium tumefaciens kulturer, transgene planter som uttrykker putative suppressors, pode og cellekultur^{9,10,11,12,13}.

Hver av disse analyser har fordeler og ulemper, og identifiserer VSRs på sin egen distinkte måte. En av de vanligste tilnærmingene er basert på samtidig infiltrasjon av individuelle A. tmuefaciens kulturer som skjuler det potensielle virale proteinet og et reportergen (typisk grønt fluorescerende protein [GFP]) på Nicotiana benthamiana 16c-planter som utgjør gfp under kontroll av blomkålmosaikkviruset 35S-arrangøren. I fravær av en aktiv viral deaktivering suppressor, er GFP identifisert som eksogene av vertscellene og er dempet innen 3 dager etter infiltrasjon (dpi). Derimot, hvis virusproteinet har undertrykkelsesaktivitet, forblir uttrykksnivået til GFP stabilt utover 3−9 dpi⁹. Denne koinfiltrasjonsanalysen er enkel og rask; Det er imidlertid verken svært stabilt eller følsomt. Likevel har analysen identifisert mange VSRs med ulike proteinsekvenser og strukturer i mange RNA-virus^7,8.

Nylig har flere effektorproteiner som kan hemme den cellulære RNA-deaktiveringsaktiviteten blitt karakterisert fra bakteriell, oomycete og soppplantepatogener^14,15,16. Disse funnene innebærer at RNA-deaktivering av undertrykkelse er en vanlig strategi for å legge til rette for infeksjon som brukes av patogener i de fleste riker. I teorien kan mange, om ikke alle, av effektorene kode RNA-deaktiveringssuppressorer (RSSs); Hittil har imidlertid bare noen få blitt identifisert, hovedsakelig på grunn av mangel på den pålitelige og generelle screeningstrategien. Videre har suppressors av RNA deaktivering ikke blitt undersøkt i de aller fleste plante patogener¹⁷.

I denne rapporten presenterer vi en optimalisert og generell protokoll for å identifisere plantepatogeneeffektorer som kan undertrykke lokale og systemiske RNA-deaktivering ved hjelp av agro-infiltrasjonsanalysen. Målet med denne studien var å understreke de viktigste aspektene ved protokollen og beskrive trinnene i detalj, og dermed gi en screeninganalyse som passer for nesten alle effektorer av plantepatogener.

Protocol

MERK: Alle trinnene i prosedyren skal utføres ved romtemperatur (RT). FORSIKTIG: Sett alle medier som inneholder patogene mikrober, samt planter og plantevev som brukes i analysen, i de riktige avfallsbeholderne og autoklaven før kassering. 1. Utarbeidelse av plasmidkonstruksjoner som inneholder antatte effektorer Velg antatte utskillede effektorer som er svært uttrykt under infeksjon, som bestemt av RNA-sekvensering (RNA-Seq), og videre av kvantitativ …

Representative Results

Ovenfor beskriver vi trinnvis prosedyre for en forbedret screeninganalyse for å vurdere RSS-aktiviteten til P. sojae RxLR-effektorer. Til sammen tar eksperimentet 5-6 uker. Deretter kan RSSs identifisert av analysen karakteriseres ytterligere når det gjelder funksjon og molekylær mekanisme. Som et eksempel på vår tilnærming brukte vi P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppressor av RNA-deaktivering 1 (PSR1), som utskilles og leveres til vertsceller gjennom haustori…

Discussion

RNA-deaktivering er en viktig forsvarsmekanisme som brukes av planter for å bekjempe virale, bakterielle, oomycete og sopppatogener. I sin tur har disse mikrobene utviklet deaktivering suppressor proteiner for å motvirke antiviral deaktivering, og disse RSSs forstyrre ulike trinn av RNA deaktivering sti^22,23. Flere screening analyser er utviklet for å identifisere RSSs¹⁰.

Her beskriver vi en forbedret protoko…

Materials

2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
2xTaq Master Mix	Vazyme Biotech	P112-AA	PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Amresco	0264C507-1KG	MOPS Buffer
Acetosyringone (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Induction of Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Agarose	Biofroxx	1110GR100	Electrophoresis
Amersham Hybond -N+	GE Healthcare	RPN303 B	Nothern blot
Amersham Imager	GE Healthcare	Amersham Imager 600	Image
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705	LB medium
Bacto Yeast Extraction	BD Biosciences	212750	LB medium
Camera	Nikon	D5100	Photography
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits	Thermo Fisher Scientific	89880	Luminescence detection
Chloramphenicol	Amresco	0230-100G	Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme Biotech	C112-01	Ligation
DIG Easy Hyb	Sigma-Aldrich	11603558001	Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit	TransGen Biotech	EM101-02	Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	TransGen Biotech	EG101-02	Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate	Amresco/VWR	0105-1KG	MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply	LiuYi	DYY6D	Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV	Thermo Fisher Scientific	FD0304	Vector digestion
Gel Image System	Tanon	Tanon3500	Image
Gentamycin	Amresco	0304-5G	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiotics
LR Clonase II enzyme	Invitrogen	11791020	LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um	GE Healthcare	10600002	Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit	Thermo Fisher Scientific	17075	Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers	Bio-Rad	T100	PCR
Peat moss	PINDSTRUP	Dark Gold + clay	Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer	ICE	Peter Professional 20-20-20	Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme Biotech	P505-d1	Enzyme
Rifampicin	MP Biomedicals	219549005	Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X)	Thermo Fisher Scientific	R0641	RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate	Amresco/VWR	0530-1KG	MOPS Buffer
Sodium Chloride	Amresco	0241-10KG	LB medium
Tri-Sodium citrate	Amresco	0101-1KG	SSC Buffer
Trizol Reagent	Invitrogen	15596018	RNA isolation reagent
UV lamp	Analytik Jena	UVP B-100AP	Observation
UVP Hybrilinker Oven	Analytik Jena	OV2000	Northern