Visualisering af makrofag lytisk celledød under mykobakterielle infektioner i Zebrafish-embryoner via Intravital mikroskopi
Summary
Denne protokol beskriver en teknik til visualisering af makrofag adfærd og død i embryonale Zebra under Mycobacterium Marinum infektion. Trin til fremstilling af bakterier, infektion af embryoner, og intravital mikroskopi er inkluderet. Denne teknik kan anvendes til observation af cellulære adfærd og død i lignende scenarier, der involverer infektion eller steril inflammation.
Abstract
Zebrafish er en fremragende model organisme til at studere medfødte immuncelle adfærd på grund af sin gennemsigtige karakter og afhængighed udelukkende på dens medfødte immunsystem under tidlig udvikling. Den Zebrafish Mycobacterium Marinum (M. Marinum) infektion model har været veletableret i at studere vært immunrespons mod mycobakteriel infektion. Det er blevet foreslået, at forskellige makrofag celledød typer vil føre til de forskellige resultater af mycobakteriel infektion. Her beskriver vi en protokol ved hjælp af intravital mikroskopi til at observere makrofag celledød i Zebra embryoner efter M. Marinum infektion. Zebrafish transgene linjer, der specifikt mærke makrofager og neutrofiler er inficeret via intramuskulær mikroinjektion af fluorescently mærket M. Marinum i enten midthjernen eller stammen. Inficerede Zebra embryoner er efterfølgende monteret på lav smeltende agopstået og observeret af Konfokal mikroskopi i X-Y-Z-T dimensioner. Da langtids levende billeddannelse kræver brug af lav laser effekt for at undgå foto blegning og fototoksicitet, anbefales det stærkt at udtrykke transgene. Denne protokol letter visualisering af de dynamiske processer in vivo, herunder immuncelle migration, vært patogen interaktion, og celledød.
Introduction
Mycobakteriel infektion er blevet påvist at forårsage Host immuncelle død1. For eksempel vil en svækket stamme udløse apoptose i makrofager og indeholde infektionen. Men en virulente stamme vil udløse lytisk celledød, forårsager bakteriel udbredelse1,2. I betragtning af virkningen disse forskellige typer af celledød har på vært anti-mykobakterielle respons, en detaljeret observation af makrofag celledød under mycobakteriel infektion in vivo er nødvendig.
De konventionelle metoder til måling af celledød er at bruge døde celle pletter, såsom annnexin V, Tunel, eller acridin orange/propidium kaliumiodid farvning3,4,5. Men disse metoder er ude af stand til at kaste lys over den dynamiske proces af celledød in vivo. Observation af celledød in vitro er allerede blevet fremmet af Live imaging6. Det er imidlertid uklart, om resultaterne nøjagtigt efterligner fysiologiske forhold.
Zebrafish har været en glimrende model for at studere Host anti-Mycobacterium svar. Det har et stærkt bevaret immunsystem, der ligner det for mennesker, et let manipulerede genom, og de tidlige embryoner er gennemsigtige, hvilket giver mulighed for levende billeddannelse7,8,9. Efter infektion med M. Marinum, voksne Zebra form typiske modne granulom strukturer, og embryonale Zebra danner tidlige granulom som strukturer9,10. Den dynamiske proces af medfødte immuncelle-bakterier interaktion er blevet udforsket tidligere i Zebra M. Marinum infektion model11,12. Men på grund af høj rumlig-temporale opløsning krav, detaljerne omkring død af de medfødte immunceller forbliver stort set udefineret.
Her beskriver vi, hvordan man visualiserer processen med makrofag lytisk celledød udløst af mycobakteriel infektion in vivo. Denne protokol kan også anvendes til at visualisere cellulære adfærd in vivo under udvikling og inflammation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver visualisering af makrofag død under mykobakterielle infektion. Baseret på faktorer såsom integriteten af cellemembranen, kan infektion drevet celledød opdeles i apoptose og lytisk celle død24,25. Lytisk celledød er mere stressende for organismen end apoptose, fordi det udløser en stærk inflammatorisk respons 24,25. Observation af lytisk celledød in vivo er vanskelig, på …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. zilong Wen for at dele Zebra stammer, Dr. Stefan oehlers og Dr. David Tobin for at dele M. Marinum relaterede ressourcer, yuepeng han for assistance i figur forberedelse. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), det udestående ungdoms uddannelses program af Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing program (18YF1420400) (B.Y.), og åben fond af Shanghai Key Laboratory of tuberkulose (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker’s guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
