Visualisering av macrophage lytisk Cell Death under Mykobakterieinfeksjoner infeksjon i sebrafisk embryo via Intravital mikroskopi
Summary
Denne protokollen beskriver en teknikk for å visualisere macrophage atferd og død i embryonale sebrafisk under Mycobacterium marinum infeksjon. Trinn for utarbeidelse av bakterier, infeksjon av embryo, og intravital mikroskopi er inkludert. Denne teknikken kan brukes til observasjon av cellulære atferd og død i lignende scenarier som involverer infeksjon eller steril betennelse.
Abstract
Sebrafisk er en utmerket modell organisme for å studere medfødt immun celle atferd på grunn av sin gjennomsiktige natur og tillit utelukkende på sin medfødte immunsystem under tidlig utvikling. Den sebrafisk Mycobacterium marinum (M. marinum) infeksjon modellen har vært godt etablert i å studere vert immunrespons mot mykobakterieinfeksjoner infeksjon. Det har blitt antydet at ulike macrophage celle døds typer vil føre til ulike utfall av mykobakterieinfeksjoner infeksjon. Her beskriver vi en protokoll som bruker intravital mikroskopi å observere macrophage celle død i sebrafisk embryo etter M. marinum infeksjon. Sebrafisk transgene linjer som spesielt Label makrofager og nøytrofile er infisert via intramuskulær microinjection av fluorescensmerkete merket M. marinum i enten mellomhjernen eller stammen. Infiserte sebrafisk embryo er senere montert på lavt smelte agarose og observert av konfokalmikroskopi mikroskopi i X-Y-Z-T dimensjoner. Fordi langsiktig Live Imaging krever bruk av lav laser effekt for å unngå photobleaching og Phototoksisitet, er en sterkt uttrykker transgene sterkt anbefalt. Denne protokollen forenkler visualisering av dynamiske prosesser in vivo, inkludert immun celle migrasjon, vert patogen samhandling, og celle død.
Introduction
Mykobakterieinfeksjoner infeksjon har vist å forårsake vert immun cellen død1. For eksempel vil en svekket belastning utløse apoptose i makrofager og inneholde infeksjonen. Imidlertid vil en ondartet belastning utløse lytisk celle død, forårsaker bakteriell formidling1,2. Betenke innvirkningen disse annerledes typer av cellen død ha opp på vert anti-mykobakterieinfeksjoner svaret, en detaljert observasjon av macrophage cellen død i løpet av mykobakterieinfeksjoner infeksjon inne Vivo er behøvde.
De konvensjonelle metodene for å måle celle død er å bruke døde celle flekker, slik som Annnexin V, TUNEL, eller Akridin Orange/propidium iodide farging3,4,5. Men disse metodene er ikke i stand til å belyse den dynamiske prosessen med celle død in vivo. Observasjon av celle død in vitro har allerede blitt tilrettelagt av Live Imaging6. Men om resultatene nøyaktig etterligne fysiologiske forhold forblir uklart.
Sebrafisk har vært en utmerket modell for å studere Host anti-Mycobacterium svar. Den har en svært bevart immunsystem som ligner på mennesker, en lett manipulert Genova, og tidlig embryo er gjennomsiktige, noe som gjør det mulig for Live Imaging7,8,9. Etter smitte med M. marinum, voksen sebrafisk form typisk modne granulom strukturer, og embryonale sebrafisk form tidlig granulom som strukturer9,10. Den dynamiske prosessen med medfødt immun celle-bakterier interaksjon har vært utforsket tidligere i sebrafisk M. marinum infeksjon modell11,12. Men på grunn av høy romlig-Temporal oppløsning kravet, detaljene rundt død av medfødte immunceller fortsatt i stor grad udefinert.
Her beskriver vi hvordan å visualisere prosessen med macrophage lytisk celle død utløst av mykobakterieinfeksjoner infeksjon in vivo. Denne protokollen kan også anvendes for å visualisere cellulær atferd i vivo under utvikling og inflammasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver visualisering av macrophage død under mykobakterieinfeksjoner infeksjon. Basert på faktorer som integriteten til cellemembranen, kan smitte drevet celle død deles inn i apoptose og lytisk celle død24,25. Lytisk celle død er mer stressende for organismen enn apoptose, fordi det utløser en sterk inflammatorisk respons 24,25. Observasjon av lytisk celle død in vivo er vansk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Zilong Wen for deling sebrafisk stammer, Dr. Stefan Oehlers og Dr. David Tobin for deling M. marinum relaterte ressurser, Yuepeng han for hjelp i figuren forberedelse. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81801977) (B.Y.), fremragende Youth Training program av Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing program (18YF1420400) (B.Y.), og Open Fund of Shanghai nøkkel laboratorium for tuberkulose (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker’s guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
