समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी द्वारा सर्वव्यापकइन चेन विश्लेषण
Summary
यह विधि सर्वव्यापक श्रृंखला टोपोलॉजी में वैश्विक परिवर्तनों के आकलन का वर्णन करती है। मूल्यांकन एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित लक्षित प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण के आवेदन द्वारा किया जाता है।
Abstract
एक प्रोटेम के भीतर सर्वव्यापी श्रृंखला topologies के वैश्विक प्रोफ़ाइल का आकलन जैविक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला का जवाब देने के लिए ब्याज की है । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल एक श्रृंखला में शामिल सर्वव्यापी के ट्राइप्टिक पाचन के बाद छोड़े गए डी-ग्लाइसिन (-जीजी) संशोधन का लाभ उठाता है। इन टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड्स को निर्धारित करके प्रत्येक सर्वव्यापक श्रृंखला टोपोलॉजी की सापेक्ष बहुतायत निर्धारित की जा सकती है। एक समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी प्रयोग द्वारा इन पेप्टाइड्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए आवश्यक कदम सर्वव्यापक श्रृंखलाओं के स्थिरीकरण को ध्यान में रखते हुए सूचित कर रहे हैं । उचित मास स्पेक्ट्रोमीटर सेटअप और डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो के साथ भारी नियंत्रण, सेल लाइसिस और पाचन की तैयारी का वर्णन किया गया है। सर्वव्यापी टोपोलॉजी में क्षोभ के साथ सेट एक उदाहरण डेटा प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें प्रोटोकॉल का अनुकूलन परिणामों को कैसे प्रभावित कर सकता है, इसके उदाहरण भी दिए जाते हैं। उल्लिखित चरणों का पालन करके, एक उपयोगकर्ता अपने जैविक संदर्भ के भीतर सर्वव्यापी टोपोलॉजी परिदृश्य का वैश्विक आकलन करने में सक्षम होगा।
Introduction
प्रोटीन समारोह और स्थिरता के करीब विनियमन सर्वोपरि महत्व का है, क्योंकि वे जीव विज्ञान के फेनोटाइपिक नियंत्रण के प्रमुख चालक हैं । प्रोटीन का कार्य दो घटकों से बनाया जाता है: इसका आंतरिक पॉलीपेप्टाइड अनुक्रम और कोई पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएमएस)। ग्लाइकोसिलेशन, फॉस्फोरिलेशन, एसिटिलेशन, और मिथाइलेशन1सहित विभिन्न रासायनिक पीटीएम की पहचान की गई है। 1975 में, गोल्डस्टीन एट अल2 ने एक छोटे प्रोटीन की पहचान की और इसे सर्वव्यापी प्रकृति के कारण सर्वव्यापी नाम दिया। प्रोटीन क्षरण3में सर्वव्यापी महत्वपूर्ण पाया गया . हालांकि, तब से यह स्थापित किया गया है कि एक संकेत अणु के रूप में सर्वव्यापकता का कार्य प्रोटीन स्थिरता के नियमन से कहीं आगे तक फैली हुई है । सर्वव्यापी संकेत प्रोटीन स्थिरीकरण, ऑटोफैगी, सेल चक्र नियंत्रण, और प्रोटीन तस्करी4जैसे अन्य जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला में शामिल है।
जबकि अन्य पीटीएम आम तौर पर बाइनरी होते हैं (यानी, प्रोटीन को किसी दिए गए साइट के लिए संशोधित या असंशोधित छोड़ दिया जाता है), सर्वव्यापी प्रोटीन को मोनोमर या पॉलीमेरिक चेन दोनों के रूप में संशोधित कर सकता है, जिसमें संलग्न सर्वव्यापकता ही सर्वव्यापी है। इसके अलावा, यह पॉलीफाउंपनेशन चेन कई टोपोलोजी में विकसित हो सकती है, जिसमें पिछले सर्वव्यापकता के सर्वव्यापकता के साथ आठ लिंकेज साइटों में से एक5,6से जुड़ा हुआ है। सर्वव्यापकता को एक मल्टीस्टेप एंजाइमैजी प्रक्रिया(चित्रा 1)द्वारा स्थानांतरित किया जाता है जहां सर्वव्यापकता का सी-टर्मिनस इसके सात लिसिन अवशेषों में से एक (K06, से जुड़ा हुआ है K11, K27, K29, K33, K48, या K63) या पिछले सर्वव्यापकता के एन-टर्मिनल (M1 या रैखिक सर्वव्यापकता के रूप में संदर्भित)5,6. यह श्रृंखला टोपोलॉजी संशोधन के तहत प्रोटीन के भाग्य के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, K48 या K11 से जुड़ी श्रृंखला के साथ संशोधन प्रोटेसोम में संशोधित प्रोटीन की गिरावट की ओर जाता है, जबकि एनएफ-केबी सिग्नलिंग की सक्रियता के लिए एक रैखिक श्रृंखला आवश्यक है। इस प्रकार, इन श्रृंखला topologies के सापेक्ष वितरण जैविक सवालों की एक विस्तृत विविधता के लिए प्रासंगिक है।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग सर्वव्यापी श्रृंखला टोपोलॉजी विश्लेषण के लिए विशेष लाभ का है क्योंकि यह एंटीबॉडी-आधारित या आत्मीयता आधारित बातचीत7,8पर निर्भर नहीं है, जिनमें से कई में सीमित विशिष्टता है और विभिन्न श्रृंखला प्रकारों के बीच अंतर नहीं है। एक अलग पता लगाने की संभावना आनुवंशिक रूप से संशोधित सर्वव्यापकता म्यूटेंट का उपयोग कर रही है। यहां आर्जिनिन के लिए एक विशिष्ट lysine का आदान-प्रदान किया जाता है, जो सर्वव्यापी द्वारा संशोधन का समर्थन नहीं कर सकता । सब्सट्रेट प्रोटीन पर सर्वव्यापकता श्रृंखला निर्माण की कमी को तब एक विशिष्ट टोपोलॉजी 9 के लिए साक्ष्य के रूप में समझाजाताहै ।
सर्वापित प्रोटीन की एमएस-आधारित पहचान इस तथ्य पर आधारित है कि सर्वव्यापकता के सी-टर्मिनस में स्थिति 74 में एक आर्जिनिन अवशेष होता है जो एमएस विश्लेषण के लिए नमूनों की प्रोटियोलिटिक तैयारी के दौरान ट्राइपसिन द्वारा मान्यता प्राप्त है, सी-टर्मिनल डबल ग्लाइसिन को अलग करता है। यह ग्लाइगली (-जीजी) सब्सट्रेट प्रोटीन के lysine अवशेषों के ε-अमीनो समूह से जुड़ा रहता है। सर्वव्यापकता टोपोलॉजी विश्लेषण के लिए, संशोधन सर्वव्यापी के सात lysine अवशेषों में से एक पर होता है। यह सात प्रमुख पेप्टाइड्स का एक सेट बनाता है जो एक lysine अवशेष ले जाता है जिसे जीजी द्वारा संशोधित किया जाता है, जो प्रत्येक टोपोलॉजी(चित्र 2)के लिए विशिष्ट है। उदाहरण के लिए, K06 टोपोलॉजी के साथ, अमीनो एसिड अनुक्रम पर स्थिति 6 पर lysine इस lysine में जोड़ा ११४ डीए के एक-GG संशोधन के साथ ट्रिप्टिक पाचन से संरक्षित किया जाएगा ।
एमएस द्वारा विशिष्ट पूर्व निर्धारित पेप्टाइड्स की पहचान को लक्षित प्रोटेओमिक्स, या अधिक विशेष रूप से लक्षित पेप्टाइड अधिग्रहण10के रूप में जाना जाता है। उपयोग किए जा रहे द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के प्रदर्शन के आधार पर दो तरीके विकसित किए गए हैं। ये चयनित रिएक्शन मॉनिटरिंग (एसआरएम) हैं, जिन्हें मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) और पैरलल रिएक्शन मॉनिटरिंग (पीआरएम) भी कहा जाता है । एसआरएम में अग्रदूत एम/जेड और उत्पाद आयन एम/जेड से मिलकर संक्रमण का चयन शामिल है । इसके विपरीत, पीआरएम को केवल अग्रदूत एम/जेड की आवश्यकता होती है। चयन के बाद, उत्पाद आयनों का पूरा सर्वेक्षण स्कैन किया जाता है। इसका लाभ यह है कि माप11से पहले विशिष्ट द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर मात्रा के लिए उपयुक्त उत्पाद आयनों का कोई चयन आवश्यक नहीं है । एसआरएम और पीआरएम दोनों, साधन के आधार पर, निर्धारित किया जा सकता है । शेड्यूलिंग एक समय खिड़की को निर्दिष्ट करने का अभ्यास है जिसके दौरान विश्लेषण के लिए एक विशेष आयन को शामिल किया जाएगा, क्योंकि पेप्टाइड्स क्रोमेग्राफिक सिस्टम से परिभाषित प्रतिधारण समय पर eluting हैं । किसी भी समय पूछताछ की जा रही आयनों की संख्या को कम करने से उस समय निर्धारित आयनों की पूछताछ की आवृत्ति बढ़ जाती है, इस प्रकार डेटा सटीकता में सुधार होता है ।
सामान्य तौर पर, सर्वव्यापकता टोपोलॉजी के लिए लक्षित प्रोटेओमिक्स का अनुप्रयोग किसी भी अन्य लक्षित प्रोटेओमिक्स प्रयोग के समान है। हालांकि, दो प्रमुख मतभेद महत्वपूर्ण हैं: पहला, सर्वव्यापक श्रृंखलाओं की स्थिरता पर विचार किया जाना चाहिए । कई शक्तिशाली डीव्यवसुत एंजाइम (डीयूबी) हैं जो तेजी से कोशिका लाइसिस पर जंजीरों को नीचा दिखाते हैं। सर्वव्यापकता-विशिष्ट प्रोटीज दो श्रेणियों में आते हैं, थिओएस्टेरेस और मेटललोप्रोटीज। अधिकांश सर्वव्यापकता-हाइड्रोलेस थिओएस्टेरेस हैं और अपने सक्रिय केंद्र में एक सिस्टीन अवशेष ले जाते हैं। इस सिस्टीन अवशेषों को एल्किलेट करके, उन्हें निष्क्रिय किया जा सकता है। जैसे, एन-एथिलमलीमाइड (एनईएम) जैसे एल्किलाटिंग एजेंटों वाले सर्वव्यापी स्थिरीकरण बफ़र्स का उपयोग, और अत्यधिक वैज्ञानिक रसायन, और नमूनों को ठंडा रखना एक सफल विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, अन्य लक्षित प्रयोगों के विपरीत, पेप्टाइड विकल्प तय किया गया है। एक विशिष्ट लक्षित प्रयोग में, अच्छे क्रोमेटोग्राफिक और आयनीकरण प्रदर्शन के लिए एक प्रोटेटीपिक पेप्टाइड का चयन किया जा सकता है। कुछ टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड्स जैसे K48 के लिए ये गुण अच्छे हैं, जबकि दूसरों के लिए, वे कम वांछनीय हैं। उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट रिवर्स-फेज सेटअप में K33 क्रोमेटोग्राफी एक विस्तारित एल्यूशन प्रोफाइल के गठन के कारण खराब है, और K27 पेप्टाइड के खराब आयनीकरण गुण एमएस12द्वारा इसकी दृश्यता को कम करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, हम पीआरएम द्वारा जैविक नमूने के सर्वव्यापक टोपोलॉजी मूल्यांकन करने का तरीका बताते हैं। प्रक्रिया के लिए उदाहरण डेटा कई अलग-अलग सेल प्रकारों में एमजी-132 अवरोधक उपचार का उपयोग करके प्रोटेसोम के एक क्षोभ का उपयोग करके प्रस्तुत किए जाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक प्रोटेओम के भीतर सर्वव्यापी राज्य का विश्लेषण जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत विविधता के लिए महत्व बढ़ाने का है। एक नमूने की सर्वव्यापकता स्थिति का वर्णन न केवल प्रोटीन के प्रोफ़ाइल सर्वव्यापी होने …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक एमजी-132 के उपचार के साथ सेलुलर छर्रों के निर्माण में उसकी सहायता के लिए सेलिन जेनेटी को धन्यवाद देना चाहते हैं जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित है और प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ई. कोलाई छर्रों के प्रावधान के लिए एलिस मोमएर्ट्स।
Materials
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
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