Ubiquitin-kjedeanalyse ved parallell reaksjonsovervåking
Summary
Denne metoden beskriver vurderingen av globale endringer i allestedsnærværende kjedetopologi. Vurderingen utføres ved bruk av en massespektrometribasert målrettet proteomikktilnærming.
Abstract
Vurdering av den globale profilen til allestedsnærværende kjedetopologier i et proteom er av interesse for å svare på et bredt spekter av biologiske spørsmål. Protokollen som er skissert her, drar nytte av di-glycin (-GG) modifikasjonen som er igjen etter den tryptiske fordøyelsen av allestedsnærværende inkorporert i en kjede. Ved å kvantifisere disse topologi-karakteristiske peptidene kan den relative overfloden av hver allestedsnærværende kjedetopologi bestemmes. Trinnene som kreves for å kvantifisere disse peptidene ved et parallelt reaksjonsovervåkingseksperiment, rapporteres med tanke på stabilisering av allestedsnærværende kjeder. Forberedelse av tunge kontroller, cellelys og fordøyelse beskrives sammen med riktig massespektrometeroppsett og arbeidsflyt for dataanalyse. Et eksempel på datasett med perturbasjoner i allestedsnærværende topologi presenteres, ledsaget av eksempler på hvordan optimalisering av protokollen kan påvirke resultatene. Ved å følge trinnene som er skissert, vil en bruker kunne utføre en global vurdering av det allestedsnærværende topologilandskapet i sin biologiske kontekst.
Introduction
Den nære reguleringen av proteinfunksjon og stabilitet er av avgjørende betydning, da de er viktige drivere for fenotypisk kontroll av biologi. Funksjonen til et protein er konstruert av to komponenter: dens iboende polypeptidsekvens og eventuelle posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMer). Ulike kjemiske PTMer er identifisert, inkludert glykosylering, fosforylering, acetylering og metylering1. I 1975 identifiserte Goldstein et al.2 et lite protein og kalte det allestedsnærværende på grunn av sin allestedsnærværende natur. Ubiquitin ble funnet å være viktig i proteinforringelse3. Men siden da har det blitt fastslått at funksjonen til allestedsnærværende som et signalmolekyl strekker seg langt utover reguleringen av proteinstabilitet. Ubiquitin signalering er involvert i et bredt spekter av andre biologiske funksjoner, for eksempel proteinstabilisering, autofagi, cellesykluskontroll og proteinhandel4.
Mens andre PTMer generelt er binære (dvs. proteinet er modifisert eller forlatt umodifisert) for et gitt sted, kan allestedsnærværende modifisere et protein både som en monomer eller som en polymerkjede, med den vedlagte allestedsnærværende selv som allestedsnærværende. Videre kan denne polyubiquitination kjeden utvikle seg i flere topologier med allestedsnærværende av den forrige allestedsnærværende feste til en av åtte koblingssteder5,6. Ubiquitin overføres av en multistep enzymatisk prosess (Figur 1) der C-terminus av ubiquitin er knyttet til en av sine syv lysinrester (K06, K11, K27, K29, K33, K48 eller K63) eller N-terminalen til den forrige allestedsnærværende (referert til som M1 eller lineær allestedsnærværende)5,6. Denne kjedetopologien er nøkkelen til proteinets skjebne under modifikasjon. For eksempel fører modifikasjonen med en K48 eller K11 koblet kjede til nedbrytning av det modifiserte proteinet ved proteasomet, mens en lineær kjede er nødvendig for aktivering av NF-kB-signalering. Dermed er den relative fordelingen av disse kjedetopologiene relevant for et bredt spekter av biologiske spørsmål.
Bruken av massespektrometri (MS) er spesielt fordelaktig for allestedsnærværende kjedetopologianalyse, da den ikke er avhengig av antistoffbaserte eller affinitetsbaserte interaksjoner7,8, hvorav mange har begrenset spesifisitet og ikke skiller mellom de ulike kjedetypene. En annen deteksjonsmulighet er å bruke genetisk modifiserte allestedsnærværende mutanter. Her byttes en bestemt lysin mot arginin, som ikke kan støtte modifikasjonen av ubiquitin. Mangelen på allestedsnærværende kjededannelse på substratproteinet tolkes deretter som bevis for en bestemt topologi9.
MS-basert identifikasjon av allestedsnærværende proteiner er basert på det faktum at C-terminus av allestedsnærværende inneholder en argininrester i posisjon 74 som gjenkjennes av trypsin under proteolytisk fremstilling av prøvene for MS-analyse, som skiller C-terminal dobbel glycin. Denne GlyGly (-GG) forblir festet til ε-aminogruppen av lysinrester av substratproteinet. For allestedsnærværende topologi analyse skjer modifikasjonen på en av de syv lysinrester av ubiquitin. Dette oppretter et sett med syv viktige peptider som bærer en lysinrester som er modifisert av GG, spesifikk for hver av topologiene (Figur 2). For eksempel, med K06 topologi, vil lysinen i posisjon 6 på aminosyresekvensen bli beskyttet mot tryptisk fordøyelse med en -GG-modifikasjon på 114 Da lagt til denne lysinen.
Identifisering av spesifikke forhåndsbestemte peptider av MS kalles målrettet proteomikk, eller mer spesifikt, målrettet peptidanskaffelse10. To metoder er utviklet avhengig av ytelsen til massespektrometeret som brukes. Dette er valgt reaksjonsovervåking (SRM), også kalt multippel reaksjonsovervåking (MRM), og parallell reaksjonsovervåking (PRM). SRM innebærer valg av overganger som består av forløperen m/z og produktet ion m/z. På den annen side krever PRM bare forløperen m/z. Etter valg utføres en fullstendig undersøkelsesskanning av produktionene. Dette har fordelen at det ikke er nødvendig med valg av passende produktioner for kvantgering på det spesifikke massespektrometeret før målingen11. Både SRM og PRM kan, avhengig av instrumentet, planlegges. Planlegging er praksisen med å tilordne et tidsvindu der en bestemt ion vil bli inkludert for analyse, da peptider eluterer på definerte oppbevaringstider fra det kromatografiske systemet. Å redusere antall ioner som blir avhørt til enhver tid øker hyppigheten av avhør av de ionene som er planlagt på den tiden, og forbedrer dermed datanøyaktigheten.
Generelt er anvendelsen av målrettet proteomikk for allestedsnærværende topologi det samme som alle andre målrettede proteomikkeksperimenter. Imidlertid er to viktige forskjeller viktige: For det første må stabiliteten til allestedsnærværende kjeder vurderes. Det er flere potente deubiquitinating enzymer (DUB) som raskt nedbryter kjeder på cellelys. De allestedsnærværende spesifikke proteasene faller inn i to kategorier, tioesteraser og metalloproteaser. De fleste av allestedsnærværende hydrolaser er tioesteraser og bærer en cysteinrester i sitt aktive senter. Ved å alkylere denne cysteinrester, kan de inaktiveres. Som sådan er bruk av allestedsnærværende stabiliseringsbuffere som inneholder alkyleringsmidler, som N-etylmalimid (NEM), og svært denaturerende kjemikalier, og det er viktig å holde prøvene avkjølt for en vellykket analyse. For det andre, i motsetning til andre målrettede eksperimenter, er peptidvalget løst. I et typisk målrettet eksperiment kan et proteotypisk peptid velges for god kromatografisk og iioniseringsytelse. For noen topologi-karakteristiske peptider som K48 er disse egenskapene gode, mens for andre er de mindre ønskelige. For eksempel er K33-kromatografien i et typisk omvendt faseoppsett dårlig på grunn av dannelsen av en strukket elutionprofil, og de dårlige iioniseringsegenskapene til K27-peptidet reduserer synligheten med MS12.
I denne protokollen beskriver vi hvordan man utfører allestedsnærværende topologivurdering av en biologisk prøve av PRM. Eksempeldata for prosedyren presenteres ved hjelp av en perturbasjon av proteasomet ved hjelp av MG-132 hemmerbehandling i flere forskjellige celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse av allestedsnærværende tilstand i et proteom er av økende betydning for et bredt spekter av biologiske spørsmål. Beskrivelsen av allestedsnærværende tilstand av en prøve må fokusere ikke bare på profilen av proteiner som blir allestedsnærværende, men også på topologien til en slik allestedsnærværende. Vurderingen av denne topologien ved målrettet MS, som beskrevet her, har en rolle i et bredt spekter av biologiske undersøkelser.
Det skal forstås at protokollen som er…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Céline Jeanty for hennes hjelp til å lage cellulære pellets med behandling av MG-132 som beskrevet i de representative resultatene og Elise Mommaerts for hennes levering av E. coli pellets som brukes i protokollen.
Materials
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
- Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
- Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
- Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
- Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).
