यह प्रोटोकॉल बड़े प्लाज्मिड (10 केबी की सीमा तक) के साथ चार अलग-अलग गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ऑर्गेनॉइड संस्थाओं के ट्रांसफेक्शन के लिए एक कुशल इलेक्ट्रोपोरेशन विधि का वर्णन करता है। यह एक दिन के भीतर किया जा सकता है और व्यापक तैयारी या विशेष, लागत गहन इलेक्ट्रोपोराशन बफ़र्स की आवश्यकता नहीं है।
इलेक्ट्रोपोराशन प्लाज्मा झिल्ली के विद्युत पार्म्यीकरण द्वारा विभिन्न प्रकार के अणुओं के साथ ट्रांसफेक्शन के लिए एक आम विधि है। पिछले वर्षों में प्राथमिक रोगी सामग्री के लिए एक खेती विधि के रूप में ऑर्गेनॉइड के बढ़ते उपयोग के साथ, इस 3 डी संस्कृति प्रणाली में आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए घटकों के कुशल हस्तांतरण तरीकों की आवश्यकता है। विशेष रूप से ऑर्गेनॉइड के लिए, आनुवंशिक जोड़तोड़ की दक्षता एक सफल ट्रांसफेक्शन पर निर्भर करती है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल ऑर्गेनॉइड के इलेक्ट्रोपोशन को सुविधाजनक बनाने और विभिन्न संस्थाओं में अपनी सार्वभौमिक कार्यक्षमता को साबित करने के लिए विकसित किया गया था। मानव कोलोरेक्टल, अग्नाशय, हेपेटिक और गैस्ट्रिक कैंसर ऑर्गेनॉइड की तुलना में छोटे और बड़े प्लाज्मिड के साथ सफलतापूर्वक इलेक्ट्रोपोरेट किए गए थे। जीएफपी एन्कोडिंग वैक्टर के आधार पर, ट्रांसफेक्शन दक्षता एफएसीएस द्वारा निर्धारित की गई थी। कोशिकाओं या विशेष, लागत-गहन विद्युत बफ़र्स की कोई व्यापक तैयारी आवश्यक नहीं है, और प्रोटोकॉल एक दिन के भीतर किया जा सकता है।
हाल के वर्षों में, एक उपन्यास 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली, जिसे ऑर्गेनॉइड कहा जाता है, विभिन्न सामान्य और कैंसर ऊतकों के लिए विकसित किया गया था। ऑर्गेनॉइड कार्यात्मक रूप से और रूपात्मक रूप से उनके मूल के ऊतकों के बहुत करीब होते हैं। वे विभिन्न प्रजातियों से उत्पन्न हो सकते हैं, आसानी से विस्तारयोग्य, मिलनसार रूप से स्थिर और आनुवंशिक रूप से संशोधित होते हैं, जो उन्हें आनुवंशिक जांच के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाता है1,2,3। CRISPR (संकुल नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स) /Cas9 प्रणाली जैसी जेनेटिक इंजीनियरिंग तकनीक विविध जोड़तोड़ को सक्षम करती है । क्लोन के चयन को परिभाषित मीडिया स्थितियों द्वारा महसूस किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एपीसी (एडेनोमाटोसिस पॉलीपोसिस कोलाई) नॉकआउट क्लोन4,5के लिए डब्ल्यूएनटी लिगलैंड वापसी द्वारा। वैकल्पिक रूप से, चयन मार्कर को लक्ष्यीकरण वेक्टर6,7की मरम्मत के अनुसार निर्देशित द्वारा पेश किया जाना चाहिए। इस तथ्य के कारण कि अक्सर एक से अधिक प्लाज्मिड को पेश करने की आवश्यकता होती है, एक कुशल ट्रांसफेक्शन एक महत्वपूर्ण पैरामीटर बन जाता है। इसके अतिरिक्त, अविशिष्ट ऑफ-टारगेट प्रभावों को कम करने के लिए, Cas9 एंनोटुकलीज की क्षणिक अभिव्यक्ति वांछनीय8है।
इलेक्ट्रोपोराशन डीएनए, आरएनए, प्रोटीन या अन्य मैक्रोअणुओं के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए तुलनात्मक रूप से सरल विधि है। विद्युत दालों के माध्यम से, कोशिका झिल्ली अधिक सामर्य हो जाती है और9में वृद्धि का कारण बनती है। कोलन ऑर्गेनॉइड के पहले प्रकाशित इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल में एक गुल्लक-बीएसी जीएफपी (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) व्यक्त करने वाले वेक्टर (7.4 केबी) के साथ30%दक्षता चार दिनों की प्रक्रिया 10 में पहुंच गई थी। निम्नलिखित प्रोटोकॉल एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) और कै9 एंडोन्यूलीज अनुक्रम (जैसे 9.3 केबी के साथ वेक्टर के रूप में px458) के लिए बड़े प्लाज्मिड्स एन्कोडिंग के साथ कैंसर या स्वस्थ ऑर्गेनॉइड के कुशल ट्रांसफेक्शन को सुविधाजनक बनाने के लिए विकसित किया गया था। पूरी इलेक्ट्रोपोराशन प्रक्रिया एक दिन के भीतर, विशेष इलेक्ट्रोपोशन बफ़र्स के बिना, और विभिन्न गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ऑर्गेनॉइड के बीच कम से कम तुलनीय क्षमताओं के साथ किया जा सकता है, अर्थात् अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी), कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी), कोलेंगियोकार्सिनोमा (जीसी) अंग।
यह प्रोटोकॉल विभिन्न ऑर्गेनोइड संस्थाओं के इलेक्ट्रोपोशन को करने के लिए एक कुशल, त्वरित और आसान प्रदर्शन के लिए विस्तृत निर्देश देता है। पीडीएसी, सीआरसी, सीसीसी और जीसी से प्रस्तुत ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के लिए अतिरिक्त, यह स्वस्थ ऊतक ों से प्राप्त ऑर्गेनॉइड के लिए भी सफलतापूर्वक काम करता है। प्रोटोकॉल एक दिन के भीतर किया जा सकता है। प्रकाशित ऑर्गेनोइड ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल में पूरी प्रक्रिया चार दिनों तक चली जिसमें विभिन्न प्रकार की खेती मीडिया10,21के साथ दो दिन की तैयारी शामिल है । हमारे प्रोटोकॉल में कोई विशेष पूर्वउपचार की आवश्यकता नहीं है। इलेक्ट्रोपोजन से पहले इलेक्ट्रोपोराशन बफर के साथ धोने से मीडिया के एंटीबायोटिक घटकों को धोया गया और इष्टतम बाधा मूल्यों के लिए खारा सांद्रता का समायोजन हासिल किया गया । फिर भी, एक सफल इलेक्ट्रोपोशन के लिए कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए:
कक्षों
फुजी एट अल द्वारा इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल में10 को एकल कोशिकाओं में ऑर्गेनॉइड को अलग करने और उन्हें 20 माइक्रोन सेल-छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करने की सिफारिश की जाती है। एकल कोशिकाओं के लिए हमारे हाथों में पाचन कोशिकाओं की उत्तरजीविता को दृढ़ता से कम कर देता है। जैसा कि मेरेंडा एट अल21में सुझाव दिया गया है, हमने 10-15 कोशिकाओं के समूहों में ऑर्गेनॉइड को भी विसोशिएट किया और एकल कोशिका विसोशन की तुलना में कम दक्षता निर्धारित नहीं कर सके। इलेक्ट्रोपॉरेज के बाद सफेद फोम को अलग करने के लिए यह एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है, ताकि कोई संलग्न कोशिकाएं खो न जाएं।
2डी सेल संस्कृति के लिए, यह दिखाया गया है कि 40 मिन तक 10 से अधिक के विद्युतीकरण के बाद एक पुनर्जनन समय विशेष रूप से बड़े प्लाज्मिड्स22की उत्तरजीविता और ट्रांसफेक्शन दक्षता को बढ़ाता है। परीक्षण प्रयोगों में, इसे ऑर्गेनॉइड के लिए प्रलेखित किया जा सकता है, जिससे इस प्रोटोकॉल में इलेक्ट्रोपोराशन के बाद 40 मिन का ऊष्मायन कदम हो सकता है। इलेक्ट्रोपॉरेशन से रिकवरी बढ़ाने के लिए हमने उन्हें पांच से सात दिनों23के लिए Rho-संबद्ध प्रोटीन किनेज (रॉक) अवरोधक वाई-२७६३२ के साथ सुसंस्कृत किया । इसी तरह, ग्लाइकोजन सिंथाज काइनाज़ 3 (जीएसके 3) अवरोधक CHIR99021 का अतिरिक्त पूरकीकरण एकल कोशिकाओं को10को ठीक करने में मदद करने के लिए है।
सेटिंग्स
उपयोग किए गए इलेक्ट्रोपोरेटर के फायदों में से एक यह है कि बाधा को इष्टतम स्थितियों के लिए इलेक्ट्रोपोराशन से पहले मापा जा सकता है। निर्माता के अनुसार बाधा मान 30-55 होनी चाहिएω। हमारे हाथों में 30-40 के बाधा मानहैंω ने इष्टतम क्षमता दिखाई है। प्रारंभिक प्रयोग में, जीवित रहने की दक्षता का इष्टतम अनुपात खोजने के लिए पोरिंग पल्स के विभिन्न वोल्टेज और पल्स लंबाई मूल्यों को अलग-अलग किया गया था। सारांश में, हम यहां वर्णित विभिन्न संस्थाओं में फुजी एट अल10 के वर्णित मूल्यों की पुष्टि कर सकते हैं।
डीएनए
विभिन्न डीएनए मात्रा के प्रभाव का परीक्षण प्रारंभिक प्रयोगों में प्रति नमूने के ४५ μg डीएनए तक किया गया था । कोई साइटोटॉक्सिक प्रभाव का पता नहीं लगाया जा सका। संतृप्ति और 30 μg के साथ एक खुराक निर्भर तरीके से ट्रांसफेक्शन दक्षता में वृद्धि की गई थी। इसलिए, हमने अंतिम प्रोटोकॉल में प्रति नमूना 30 μg का उपयोग किया, लेकिन निश्चित रूप से इसे बढ़ाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, समानांतर में अधिक प्लाज्मिड के इलेक्ट्रोपोराशन के लिए)। इसके अतिरिक्त, डीएनए की शुद्धता और एकाग्रता बहुत महत्वपूर्ण प्रतीत होती है। 5 μg/μL से अधिक एकाग्रता इष्टतम ट्रांसफेक्शन क्षमता दिखाया गया है ।
जैसा कि उम्मीद थी, 9.3 केबी प्लाज्मिड छोटे 4.2 केबी प्लाज्मिड (देखें चित्रा 4)की तुलना में कम दक्षता से ट्रांसकिया जा सकता है। 10 केबी से भी बड़े प्लाज्मिड ्स के उपयोग से दक्षता में और कमी होने का अनुमान है। भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए, एक वेक्टर के रूप में मिनीसर्कल डीएनए का परीक्षण करना दिलचस्प हो सकता है, क्योंकि इन जीन वाहकों में प्लाज्मिड की बैक्टीरियल रीढ़ की कमी होती है जो उन्हें24से छोटा बनाती है। इसके परिणामस्वरूप बढ़ी हुई ट्रांसफेक्शन दक्षता होनी चाहिए। इसके अलावा, CRISPR आधारित ऑर्गेनॉइड के जोड़तोड़ के लिए एक रिपोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) परिसर के रूप में Cas9 से बंधे एसजीआरएनए का एक सीधा इलेक्ट्रोपोशन एक विकल्प या इसके अलावा25हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए जूलियन फोहग्रब, ऐन-क्रिस्टीन मेनेके और मैक्स हीडुक का शुक्रिया अदा करते हैं। ड्यूश क्रेबशिल्फ (कोई 111350 और 70112925), सैंडर स्टिफतुंग (कोई 2014.104.1), हेक्टर स्टिफतुंग (कोई M65.2) और यूरोपीय संघ (ईआरसी नंबर 639050) द्वारा वित्तपोषण प्रदान किया गया था।
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. |