Retrograde sporing af Drosophila embryonale motoriske neuroner ved hjælp af lipofile fluorescerende farvestoffer
Summary
Vi beskriver en metode til tilbagesporing af Drosophila embryonale motor neuroner ved hjælp af lipofile fluorescerende farvestoffer.
Abstract
Vi beskriver en teknik til tilbage mærkning af motoriske neuroner i Drosophila. Vi bruger en olie-opløst lipofile farvestof og levere en lille dråbe til en embryonal filet forberedelse af en mikroinjektor. Hver motor neuron, hvis membran er kontaktet af dråbe kan derefter hurtigt mærkes. Individuelle motoriske neuroner mærkes kontinuerligt, så fine strukturelle detaljer kan visualiseres tydeligt. I betragtning af, at lipofile farvestoffer kommer i forskellige farver, teknikken giver også et middel til at få tilstødende neuroner mærket i flerfarvet. Denne sporings teknik er derfor nyttig til at studere neuronal morfogenesis og synaptisk konnektivitet i motorens neuron system af Drosophila.
Introduction
Den embryonale motor neuron system af Drosophila tilbyder en kraftfuld eksperimentel model til at analysere de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af centralnervesystemet (CNS)1,2,3. Motoren neuron systemet er modtagelig for biokemiske, genetiske, billeddannelse, og elektrofysiologiske teknikker. Ved hjælp af teknikker, genetiske manipulationer og funktionelle analyser kan udføres på niveau med enkelt motor neuroner2,4,5,6.
Under den tidlige udvikling af nervesystemet, Neuro Blaster kløft og generere et stort antal af glia og neuroner. Det rumlige forhold mellem delaminering og Neuro Blaster-profilen for genekspression er tidligere blevet undersøgt i detaljer7,8,9. For så vidt angår motorens neuron system, er dannelsen af embryonale neuromuskulære Junction (nmj) blevet grundigt undersøgt ved hjælp af aCC (anterior Corner Cell), RP2 (rå rejer 2), og RP5 motor neuroner2,10. For eksempel, når RP5 motor neuron danner en spirende synaptisk Junction, den præ-synaptisk og post-synaptisk filopodia er sammenblandet11,12,13. En sådan direkte cellulær kommunikation er afgørende for at initiere NMJ dannelse. I modsætning til hvad vi ved om de perifere nerve grene, er vores viden om, hvordan motor dendritter initierer synaptisk konnektivitet inden for CNS, stadig primitiv.
I denne rapport præsenterer vi en teknik, der tillader tilbage mærkning af motoriske neuroner i embryoner ved hjælp af mikropipette medieret levering af lipofile farvestoffer. Denne teknik gør det muligt for os at spore de 38 motor neuroner endelser hver af de 30 kropsvæg muskler i en Hemi-segment på 15 h efter æglægning (AEL)14. Ved at bruge denne teknik, har vores gruppe grundigt undersøgt talrige gevinst-af-funktion/tab-of-funktion alleler15,16,17. Vi har for nylig trævlet de molekylære mekanismer, der driver initiering af motor dendrit tilslutningsmuligheder og viste, at en Dscam1-Dock-Pak interaktion definerer stedet for dendrit udvækst i aCC motor neuron17. I almindelighed, denne teknik er tilpasningsdygtig til fænotypiske analyse af enhver embryonale motoriske neuroner i vilde type eller mutant stammer, forbedre vores evne til at give ny indsigt i den funktionelle design af Drosophila nervesystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brugen af farvemærkning for at studere neuronal morfologi har flere fordele i forhold til genetiske celle-mærkning teknikker. Den farvemærkning teknik kan minimere mængden af tid, der er nødvendige for mærkning og billeddannelse morfologier af motor neuroner. Den farvemærkning proces er ganske hurtigt, da det tager mindre end 2 h og gør det muligt for os at definere skitse af neuronal projektioner. Som et alternativ, kan man visualisere aCC motor neuron ved at vælge en GAL4 linje, der udtrykker gæren GAL4 trans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer af Kamiyama Lab for kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en NIH R01 NS107558 (til M.I., K.B. og D.K.).
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. 발생학. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- . Drosophila Ringer’s solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
