हम एक दो भाग प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग को जोड़ती है, जिससे प्रयोगकर्ता को एकल-कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ कैल्शियम गतिविधि के पैटर्न को सहसंबंधित करने की अनुमति मिलती है।
सहज इंट्रासेलुलर कैल्शियम गतिविधि विभिन्न प्रकार के कोशिका प्रकारों में देखी जा सकती है और विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाने का प्रस्ताव है। विशेष रूप से, भ्रूण के दौरान कैल्शियम गतिविधि पैटर्न का उचित विनियमन कशेरुकी तंत्रिका विकास के कई पहलुओं के लिए आवश्यक है, जिसमें उचित तंत्रिका ट्यूब बंद होना, सिनैप्टोजेनेसिस और न्यूरोट्रांसमीटर फेनोटाइप विनिर्देश शामिल हैं। जबकि अवलोकन है कि कैल्शियम गतिविधि पैटर्न दोनों आवृत्ति और आयाम में अलग कर सकते है एक सम्मोहक तंत्र है जिसके द्वारा इन प्रवाह डाउनस्ट्रीम प्रभावकों को इनकोडेड संकेतसंचारित और जीन अभिव्यक्ति को विनियमित कर सकते है पता चलता है, मौजूदा जनसंख्या स्तर के दृष्टिकोण में इस संभावना का पता लगाने के लिए आवश्यक परिशुद्धता का अभाव है । इसके अलावा, ये दृष्टिकोण सेल-सेल संपर्क के अभाव में न्यूरोनल दृढ़ संकल्प की स्थिति को परखने की क्षमता को पहले से ही सेल-सेल इंटरैक्शन की भूमिका के अध्ययन को सीमित करते हैं। इसलिए, हमने एक प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह की स्थापना की है जो सिटू संकरण परख में फ्लोरोसेंस के साथ डिसोसिएट न्यूरोनल एक्सप्लांट्स के समय-चूक कैल्शियम इमेजिंग को जोड़ता है, जिससे आणविक के साथ कैल्शियम गतिविधि पैटर्न के स्पष्ट सहसंबंध की अनुमति होती है सिंगल-सेल स्तर पर फेनोटाइप। हम क्रमशः तंत्रिका कोशिकाओं और तंत्रिका जनक कोशिकाओं में अंतर से जुड़े विशिष्ट कैल्शियम गतिविधि पैटर्न को अलग करने और चित्रित करने के लिए इस दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक उपयोग करने में सक्षम थे; इससे परे, हालांकि, इस लेख में वर्णित प्रायोगिक ढांचे को किसी भी समय-श्रृंखला गतिविधि प्रोफ़ाइल और जीन या ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति के बीच सहसंबंधों की जांच करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
मुफ्त साइटोसोलिक कैल्शियम विभिन्न प्रकार की जैविक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें कोशिका प्रसार और प्रवास से लेकर एपोप्टोसिस और ऑटोफैगी1,2,3तक शामिल हैं। इन रास्तों के भीतर, कैल्शियम प्रोटीन गतिविधि और बातचीत को मिलाने वाले प्रवक्ता परिवर्तनों को प्रेरित करने के लिए कैल्शियम-बाध्यकारी डोमेन के साथ बातचीत करके जीन अभिव्यक्ति पर डाउनस्ट्रीम प्रभाव डाल सकता है। उदाहरण के लिए, एक न्यूरोनल कैल्शियम सेंसर जिसे डाउनस्ट्रीम रेगुलेटरी एलिमेंट विरोधी मॉड्यूलेटर (ड्रीम) के नाम से जाना जाता है, कैल्शियम से बंधे होने पर एक सामने आया मध्यवर्ती संरचना में आयोजित किया जाता है, जो इसे अपने प्रोटीन और डीएनएलक्ष्य4के साथ बातचीत करने से रोकता है। एक साधारण संकेत अणु के रूप में सेवा करने से परे, हालांकि, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम ट्रांसिएंट्स की गतिशील प्रकृति इन गतिविधि पैटर्न को अधिक जटिल आयाम-या आवृत्ति आधारितसंकेतों कोएन्कोड करने की अनुमति देती है5,6। सक्रिय टी-कोशिकाओं (NFAT) के प्रतिलेखन कारक परमाणु कारक के परमाणु स्थानांतरण उच्च आवृत्ति कैल्शियम दोलनों द्वारा बढ़ाया जाता है, लेकिन कम आवृत्ति दोलन ों से बाधित7। मजबूर, हाल के काम का सुझाव दिया है कि NFAT वास्तव में संचयी कैल्शियम एक्सपोजर8के लिए उत्तरदायी हो सकता है । कैल्सिनेरिन और सीए2 +/calmodulin-निर्भर प्रोटीन किनेज II (CaMKII) दोनों भी एक विशिष्ट आवृत्ति, अवधि, या आयाम9के कैल्शियम यात्रियों के लिए अलग प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं । नियामक जटिलता का एक अतिरिक्त स्तर जोड़ने के लिए, कम्प्यूटेशनल मॉडल का सुझाव है कि कई डाउनस्ट्रीम कैल्शियम-बाध्यकारी प्रोटीन बाध्यकारी प्रतियोगियों की उपस्थिति या अनुपस्थिति के जवाब में कम या ज्यादा आवृत्ति-निर्भर हो जाते हैं10,11।
विकासशील तंत्रिका तंत्र के भीतर, कैल्शियम गतिविधि व्यवहार के दो मुख्य वर्गों को परिभाषित किया गया है और विशिष्ट जैविक प्रक्रियाओं से जुड़ा हुआ है। कैल्शियम प्रवाह को “स्पाइक्स” के रूप में वर्गीकृत किया जाता है यदि वे व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर होते हैं, तो पांच सेकंड के भीतर बेसलाइन के ~ 400% की चोटी तीव्रता तक पहुंचते हैं, और डबल घातीय क्षय12प्रदर्शित करते हैं। इस प्रकार का संकेत मुख्य रूप से न्यूरोट्रांसमीटर फेनोटाइप स्पेसिफिकेशन13से जुड़ा हुआ है । इसके विपरीत, “तरंगों” को धीमी, कम चरम कैल्शियम यात्रियों के रूप में परिभाषित किया गया है जिसमें एक कोशिका की इंट्रासेलुलर कैल्शियम एकाग्रता तीस सेकंड या उससे अधिक की अवधि में बेसलाइन के ~ 200% तक बढ़ जाती है, फिर कई मिनट12पर क्षय हो जाती है। ये संकेत अक्सर कई पड़ोसी कोशिकाओं में प्रचारित होते हैं, और उनकी उपस्थिति न्यूराइट आउटग्रोथ और सेल प्रसार14,15से जुड़ी हुई है। हालांकि, हालांकि इन दो वर्गों को विशिष्ट गतिज प्रोफाइल के आधार पर परिभाषित किया गया है, यह स्पष्ट नहीं है कि वास्तव में इन पैटर्न की विशेषताओं का पता कोशिकाओं द्वारा लगाया जा रहा है और डाउनस्ट्रीम प्रभावकों द्वारा अनुवादित किया जा रहा है।
इंट्रासेल्युलर कैल्शियम दोलनों और जीन अभिव्यक्ति के बीच संबंधों को समझना नियामक तंत्र में से एक में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा जो तंत्रिका तंत्र के उचित विकास और पैटर्न को सुनिश्चित करता है। इस उद्देश्य के लिए, भ्रूणरी रीढ़ की हड्डी के अध्ययनों से पता चला है कि विकास के दौरान कैल्शियम स्पाइक गतिविधि में वृद्धि निरोधात्मक न्यूरॉन्स के उच्च स्तर से जुड़ी हुई है, जबकि कैल्शियम स्पाइक गतिविधि में कमी13उत्तेजक न्यूरॉन्स के उच्च स्तर से जुड़ी हुई है। हालांकि, इन जनसंख्या स्तर के परखों का उपयोग कैल्शियम गतिविधि को एकल कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के साथ संबद्ध करने के लिए नहीं किया गया है ।
एकल सेल के स्तर पर इन सवालों के पास पिछले काम पर कई अलग लाभ प्रदान करता है । एक के लिए, कई कोशिकाओं में कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने की क्षमता व्यक्तिगत रूप से एक थोक स्तर के माप द्वारा अस्पष्ट होने के बिना अलग गतिविधि पैटर्न के पूर्ण प्रदर्शनों की सूची मनाया जा करने की अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, एकल सेल प्राथमिक संस्कृति में इन संबंधों का अध्ययन करने का मतलब है कि कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति के बीच सेल स्वायत्त संबंधबनाए रखा जाएगा, जबकि सेल सेल संचार की आवश्यकता होती है बातचीत निरस्त किया जाएगा । इसलिए, यह दृष्टिकोण इन सेल-स्वायत्त तंत्रों को अलगाव में अध्ययन करने की अनुमति देता है। हालांकि, यह गैर-सेल-स्वायत्त कैल्शियम गतिविधि की भूमिका को स्पष्ट और पूछताछ करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को तंत्रिका प्लेट चरण में एक भ्रूण से विच्छेदित किया जा सकता है, जब तक भाई नियंत्रण तंत्रिका ट्यूब चरण तक पहुंचने तक सुसंस्कृत, और फिर उन कोशिकाओं की तुलना में जो तंत्रिका-ट्यूब-चरण भ्रूण से हौसले से विच्छेदित हो गए हैं। यह उन कोशिकाओं की सीधी तुलना की अनुमति देता है जिन्होंने सेल-सेल संचार को उन लोगों के लिए एक प्रमुख विकासात्मक अवधि में बनाए रखा था जिनमें सेल-सेल संचार को समाप्त कर दिया गया था।
पिछले प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों की सीमाओं को संबोधित करने की मांग में, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो व्यक्तिगत तंत्रिका जनक कोशिकाओं में कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति दोनों का आकलन करने में सक्षम होगा, जिससे बाद के भेदभाव कार्यक्रमों के साथ विशिष्ट गतिविधि पैटर्न के सहसंबंध को सुविधाजनक बनाया जा सकेगा। तंत्रिका ऊतक को तंत्रिका विकास के विभिन्न चरणों में ज़ेनोपस लेवेइस से विच्छेदित किया गया था, जो एकल कोशिकाओं में अलग हो गया था, और फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक की उपस्थिति में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से छवि था। लाइव सेल इमेजिंग के बाद, नमूने तय किए गए और एक जीन या ब्याज के आइसोफॉर्म की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस के माध्यम से परख े । महत्वपूर्ण बात, व्यक्तिगत कोशिकाओं दोनों इमेजिंग प्रयोगों में ट्रैक किया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि एक सेल के कैल्शियम गतिविधि प्रोफ़ाइल और उसके जीन अभिव्यक्ति स्तर एक दूसरे के साथ जुड़ा हो सकता है(चित्रा 1)। यहां सूचित प्रोटोकॉल का उद्देश्य ज़ेनोपस लेवेइसमें भ्रूणीय तंत्रिका विकास में कैल्शियम गतिविधि पैटर्न और जीन अभिव्यक्ति के बीच संबंधों की जांच करना है । हालांकि, व्यापक प्रयोगात्मक ढांचे (एकल सेल समय पाठ्यक्रम इमेजिंग मछली और छवि सहपंजीकरण के बाद) को संशोधित किया जा सकता है और लगभग किसी भी सेल प्रकार, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और ब्याज के जीन पर लागू किया जा सकता है।
कैल्शियम गतिविधि के विशिष्ट पैटर्न कोशिकाओं में देखे गए हैं जो विकासशील तंत्रिका तंत्र बनाते हैं, विशिष्ट प्रकार की गतिविधि के साथ अलग-अलग न्यूरोडेवलपमेंटल प्रक्रियाओं से जुड़े होते हैं। हालांकि, तंत्र है जिसके द्वारा इन सूचना घने गतिविधि पैटर्न प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं में अनुवाद कर रहे है की आगे की समझ कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति के बारे में जानकारी की आवश्यकता है एकल सेल संकल्प के साथ एकत्र किया जाएगा । जबकि सिस्टम है कि इस तरह के परिपक्व न्यूरॉन्स के रूप में और अधिक टकसाली कैल्शियम गतिविधि, प्रदर्शन, यथोचित एक थोक स्तर पर परे किया जा सकता है, अनियमित पैटर्न है कि भ्रूण तंत्रिका तंत्र की विशेषता आसानी से कम सटीक रिकॉर्डिंग से नकाबपोश हैं ।
इस प्रोटोकॉल में स्थापित प्रायोगिक ढांचा आसानी से विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के अनुकूल है। ऊतक जिसमें लगभग किसी भी कोशिका प्रकार या कोशिका प्रकार के संयोजन होते हैं, ब्याज के मॉडल जीव से विच्छेदित किया जा सकता है और एकल-कोशिका इमेजिंग के लिए चढ़ाया जा सकता है। सेल पहचान की अनुमति देने और सेल-स्वायत्त प्रक्रियाओं के प्रभाव को अलग करने के अलावा, एक प्राथमिक सेल संस्कृति दृष्टिकोण प्रयोगकर्ता को वांछित के रूप में मीडिया घटकों को परिभाषित करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, 2 एमएम सीए2 + समाधान में न्यूरोनल अग्रदूतों की गतिविधि की तुलना करने वाले प्रयोगों को यह जांचने के लिए किया गया है कि क्या भ्रूणरी रीढ़ की हड्डी में स्पाइक फ्रीक्वेंसी और न्यूरोट्रांसमीटर फेनोटाइप के बीच संबंधों को कोशिका-कोशिका इंटरैक्शन13,20के प्रभाव के बिना फिर से तैयार किया जा सकता है।
हालांकि यह प्रोटोकॉल इंट्रासेलर कैल्शियम गतिविधि का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर Fluo4-AM का लाभ उठाता है, चयन मानदंडों के आधार पर, उपयोगकर्ता आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों सहित अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मार्कर21का चयन कर सकते हैं। इसी तरह, वैकल्पिक मार्कर का उपयोग ब्याज के आयन (कश्मीर+,एनए+और जेडएन2 +सहित),झिल्ली क्षमता, या सेलुलर पीएच की एकाग्रता में गतिशील परिवर्तनों की निगरानी के लिए किया जा सकता है। इमेजिंग सेटिंग्स और इमेज अवधि को आवश्यक के रूप में संशोधित किया जा सकता है।
यद्यपि हमने कैल्शियम गतिविधि और न्यूरोनल फेनोटाइप को एक विशिष्ट अनुप्रयोग के रूप में सहसंबद्ध किया है, यह विधि विभिन्न अन्य सेलुलर गुणों के लिए भी लागू होती है। उदाहरण के लिए, सीटू संकरण में फ्लोरेसेंस को ब्याज के किसी भी जीन के खिलाफ जांच के साथ किया जा सकता है, जिसमें न्यूरोनल मार्कर चाट या ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर Engrailed शामिल है, जिससे एमआरएनए प्रजातियों के अनुकूलन योग्य पैनल का संवेदनशील पता लगाया जा सकता है। इन जांचों को आइसोफॉर्म-विशिष्ट होने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, यदि वांछित हो तो अतिरिक्त लक्ष्य विशिष्टता का समर्थन किया जा सकता है। डबल मछली कई दो अलग-अलग फ्लोरोफोरस के लिए संयुग्मित जांच का उपयोग करके किया जा सकता है, जिससे कई जीन की अभिव्यक्ति का एक साथ आकलन हो ता है। हालांकि, इस प्रकार के प्रयोग के लिए आवश्यक अतिरिक्त वॉश सेल हानि या आंदोलन की बढ़ी हुई संभावना से जुड़े होते हैं और सफलतापूर्वक किए जाने वाले अनुभव और विनम्रता की आवश्यकता होती है।
इस प्रोटोकॉल में किए गए किसी भी प्रयोग-विशिष्ट संशोधनों के बावजूद, कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है। सभी दूषित ऊतकों या कोशिका आबादी को दूर करने के लिए देखभाल के साथ विच्छेदन किया जाना चाहिए; क्योंकि जब एक्सप्लांट्स को अलग किया जाता है तो स्थानिक पैटर्नखो जाता है, पड़ोसी ऊतकों से कोई भी शेष कोशिकाएं ब्याज की कोशिकाओं से अलग और अविवेच्य हो जाएंगी। कोशिकाओं को चढ़ाया जाने के बाद, कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने से रोकने के लिए नमूनों को धीरे से संभाला जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण बात, इसका मतलब यह है कि सभी समाधान परिवर्तन धीरे और ध्यान से किया जाना चाहिए, प्लेट के किनारे पर रखा पिपेट के साथ जब समाधान हटाया जा रहा है और जोड़ा जा रहा है । यह सुनिश्चित करेगा कि कैल्शियम और मछली दोनों छवियों में कोशिकाओं की आत्मविश्वास से पहचान की जा सकती है। यदि प्रसंस्करण के दौरान कोशिकाएं बाधित होती हैं, तो दो छवियों के बीच कुछ या सभी संबंधित कोशिकाओं की पहचान करना असंभव हो सकता है। हम इन कार्यों के साथ सावधानी के पक्ष में गलती की सलाह देते हैं, जैसे कि केवल स्पष्ट रूप से संबंधित कोशिकाओं को आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है।
जैविक प्रश्न को संबोधित किए जाने के आधार पर, विभिन्न प्रकार के विश्लेषण दृष्टिकोण उपयुक्त हो सकते हैं। समय-श्रृंखला कैल्शियम गतिविधि को विभिन्न तरीकों से संसाधित और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जिसमें डी-ट्रेंडिंग पैरामीटर, विश्लेषण मीट्रिक और विश्लेषण मापदंडों को चुनने में प्रयोगकर्ता लचीलापन होता है (उदाहरण के लिए, कैल्शियम स्पाइक को परिभाषित करने के लिए उपयोग की जाने वाली आधारभूत सीमा का%)। कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति के स्तर के बीच सहसंबंध मछली छवि से निकाले गए एक निरपेक्ष या सापेक्ष फ्लोरेसेंस मूल्य के रूप में जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके तैयार किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कैल्शियम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति (उपस्थिति/अनुपस्थिति) के बीच सहसंबंध सकारात्मक जीन अभिव्यक्ति संकेत के लिए एक फ्लोरेसेंस दहलीज को परिभाषित करके और व्यक्तिगत कोशिकाओं को ‘ हां ‘ या ‘ नहीं ‘ पहचानकर्ताओं को निर्दिष्ट करके तैयार किया जा सकता है । कुल मिलाकर, यह प्रायोगिक स्कीमा सेल-मिलान जीन अभिव्यक्ति डेटा के साथ संयोजन के रूप में समय-श्रृंखला डेटा के संग्रह और प्रारंभिक विश्लेषण के लिए एक अविश्वसनीय रूप से लचीली पाइपलाइन प्रदान करता है। इस तरह के प्रयोग सेलुलर गतिशीलता और प्रतिलेखन परिवर्तनों के बीच जटिल संबंधों को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण होंगे, जैसा कि भ्रूणीय ज़ेनोपस लेवेइसमें निरोधात्मक-वसायुक्त और उत्तेजक-fated न्यूरोनल अग्रदूतों की विशेषता कैल्शियम गतिविधि पैटर्न की पहचान से उदाहरण है।
The authors have nothing to disclose.
हम इन प्रोटोकॉल के विकास के लिए उनके योगदान के लिए वेंडी हर्बस्ट और लिंडसे श्लीफर का शुक्रिया अदा करते हैं । इस कार्य को एमएसएस को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 और 1R15HD096415-01) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
For Animal Husbandry & Cell Culture | |||
CHORULON (chorionic gonodotropin) | Merck Animal Health | ||
Gentamycin sulfate salt | Millipore Sigma | G1264 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm | Millipore Sigma | CLS3160102 | |
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm | Fisher Scientific | 08-772A | |
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Fisher Scientific | 12-565-90 | |
Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521 | |
Collagenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
Dumont #55 Forceps, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Dumont #5 Forceps, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-00 | |
Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface | Nexcelom Bioscience | CLS5-25D-050 | |
For Calcium Imaging | |||
Fluo-4, AM, cell permeant | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Thermo Fisher Scientific | P6866 | |
For RNA Probe Generation | |||
PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
rATP | Promega | P1132 | |
rCTP | Promega | P1142 | |
rGTP | Promega | P1152 | |
rUTP | Promega | P1162 | |
Digoxigenin-11-UTP | Millipore Sigma | 3359247910 | |
Rnase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | N8080119 | |
T3 RNA Polymerase | Promega | P2083 | |
T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
RQ1 Rnase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
LiCl Precipitation Solution (7.5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9480 | |
For Fluorescence In Situ Hybridization | |||
Acetic Anhydride | Thermo Fisher Scientific | 320102 | |
Blocking Reagent | Millipore Sigma | 11096176001 | |
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Millipore Sigma | 11207733910 | |
Cy3 Mono-Reactive NHS Ester | Millipore Sigma | GEPA13105 | |
Solution Components | |||
Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs | Fisher Scientific | AC349610 | |
Calcium chloride dihydrate | Millipore Sigma | C3306 | |
CHAPS hydrate | Millipore Sigma | C3023 | |
Denhardt's Solution (50X) | Thermo Fisher Scientific | 750018 | |
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Millipore Sigma | E3889 | |
Formamide (Deionized) | Thermo Fisher Scientific | AM9342 | |
Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Millipore Sigma | H3393 | |
HEPES (Ultra Pure) | Thermo Fisher Scientific | 11344041 | |
Hydrogen peroxide solution | Millipore Sigma | H1109 | |
L-Cysteine | Millipore Sigma | 168149 | |
Magnesium chloride, pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC223211000 | |
Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous | Fisher Scientific | AC413480050 | |
Maleic Acid, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | ACS125231000 | |
MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP308 | |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX | Millipore Sigma | R3629 | |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S7653 | |
Triethanolamine | Millipore Sigma | 90279 | |
Tris | Millipore Sigma | GE17-1321-01 | |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P9416 | |
Equipment | |||
Laminar Flow Hood | model of choice | ||
Dissecting Microscope | model of choice | ||
Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | TE200 | |
NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
Shaking Incubator | model of choice | ||
Refrigerated Centrifuge | model of choice | ||
Miscellaneous | |||
Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 μm pore, 500 mL bottle capacity | Millipore Sigma | CLS430769 | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |