표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석
Summary
여기서 우리는 마우스 종양 제노이식 모델에서 항체의 생체 내 국소화를 연구하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
단일 클론 항체는 암세포를 제거하기 위해 가변 독립적 인 메커니즘에 의해 작동하는 높은 친화성 다기능 약물이다. 지난 수십 년 동안 항체-약물 접합, 이중 특이적 항체, 키메라 항원 수용체(CAR) 및 암 면역 요법 분야는 기본 및 치료 조사의 가장 유망한 영역으로 부상했습니다. 백혈병과 흑색종에 있는 면역 체크포인트 수용체 및 CAR-T 세포를 획기적인 속도로 표적으로 하는 수많은 성공적인 인간 적인 예심으로, 항체 공학의 변이에서 파생된 종양학 치료에 대한 매우 흥미로운 시간입니다. 유감스럽게도, 상당히 많은 수의 항체와 CAR 기반 치료법은 종양 침대에서 면역 효과기 세포의 제한된 가용성으로 인해 고형 암의 인체 실험에서 실망스러운 것으로 입증되었습니다. 중요한 것은, 종양 이외의 조직에서 치료 항체의 비특이적 분포는 또한 임상 효능의 부족, 관련 독성 및 임상 실패에 기여한다. 인간 임상 적 흔적으로 전임상 연구의 충실한 번역이 마우스 종양 xenograft 효능 및 안전 연구에 크게 의존하기 때문에, 여기에서 우리는 치료 항체의 종양 및 일반 조직 분포를 테스트하는 방법을 강조한다. 이것은 종양 베어링 마우스의 살아있는 화상 진찰에 선행된 근적외선 형광염염으로 단백질-A 정제항체를 표지하여 달성됩니다.
Introduction
FDA는 1986년1,2에서CD3(OKT3, 무로모나브)를 대상으로 한 최초의 단일클론항체를승인했다. 그 이후 20년 동안 면역 체크포인트 억제제3에대한 항체의 압도적인 성공으로 인해 항체 공학 분야에서 급속한 폭발이 있었습니다. 면역 계통의 간접적인 활성화 외에, 항체는 면역 효과기 세포를 정확하게 관여하기 위하여 암세포를 직접 플래그화하고, 죽음 수용체 작용제를 통해 세포 독성을, 종양 세포 생존 신호를 막고, 혈관 신생 (혈관의 성장), 면역 체크포인트 조절을 제한하고, 방사성 동위 원소를 전달하고, 화학 요법 약물 및 siRNA를 공자에이전트로2. 또한, 환자 유래 T세포 및 NK 세포(CAR-T 및 CAR-NK)의 표면에 다양한 항체의 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 연구하는 것은 세포 기반 치료법에 대한 임상 조사의 급속한 성장 영역이다4.
종양 세포를 발현하는 항원에게 선택성을 제공하는 항체 기반 약물의 초고친화성은 매력적인 제대리인입니다. 마찬가지로, 치료 항체(또는 화학약물)의 표적 전달 및 종양 보유는 독성에 대한 효능의 균형을 맞추는 열쇠이다. 따라서, 이중특이적5 및 삼중특이항체(6)를 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 단백질 공학 기반 전략이 정맥내(IV)의 종양 보유를 크게 향상시키는 데 이용되고 있다5,7. 여기서, 우리는 잠재적으로 효과적인 항암 항체의 종양 및 조직 분포를 해결하기 위한 간단한 형광 기반 방법을 설명한다.
동물 조직은 가시 스펙트럼에서 흥분할 때 자동 형광을 가지고 있기 때문에, 항체는 처음에 근적외선 염료로 표지되었다 (예를 들어, IRDye 800CW). 개념 조사의 증거를 위해, 우리는 엽산 수용체 알파-1 (FOLR1)의 탈구 수용체 알파-1 (FOLR1) 팔레투주맙이라고 불리는 항체와 그 유도체라는 이중 특이적 앵커 Cyto독성 활성제 (BaCa)7 항체를 공동 표적으로 하는 FOLR1 및 죽음 수용체-5 (DR5)8을 하나의 재조합 항체에서 사용했습니다. FOLR1은 난소 및 TNBC 암세포, 종양 이종이이식 및 환자 종양9에서잘 정의된 과발현 표적 수용체이다. 특히, 난소 및 유방암을 위한 면역 효과제 세포 및 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 참여시키기 위한 항체 기반접근법을이용하여FOLR1을임상적으로 악용하기 위한 여러 노력이 있다.
본 방법 논문에서, 우리는 CHO 발현 시스템을 이용한 다른 제어 항체와 함께 임상 항FOLR1(farletuzumab)을 복제, 발현 및 정제하였다. IgG1 아이소타입 및 아바고보마브(12)라고 불리는 임상 항관용형 뮤신-16 항체가 음의 대조군으로 사용되었다. 단백질-A 정화에 따라, 표시된 항체는 IRDye 800CW로 표지되었고, 난소 종양 이종이이식또는 안정적으로 전염성이 있는 인간 FOLR1을 베어링 난소 종양 xenografts 또는 안정적으로 전염성이 있는 인간 FOLR1의 꼬리 정맥으로 투여되었다. 항체 국소화는 여러 개의 상이한 시간점7에서 생체 내 이미징 스펙트럼을 이용한 라이브 이미징에 의해 추적되었다. 이 방법은 빛 방출을 가능하게 하기 위하여 기판의 어떤 유전 수정 또는 주입을 요구하지 않으며 상당히 빠르고, 비용 효과적이고 효율적입니다. 아래에 설명된 일반적인 복제, 발현, 정제 및 라벨링 프로토콜은 중형 및 광 사슬 서열을 사용할 수 있는 경우 모든 임상 및 비임상 항체에 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
항암 치료제의 선택적 및 종양 조직 특이적 전달은 주어진 표적요법(13)의효능 및 안전성 을 측정하는 열쇠이다. 여기서 우리는 임상, 팔레투주맙 및 비임상 BaCa 항체의 상세한 조직 및 종양 분포를 조사하기 위하여 신속하고 능률적인 접근을 기술했습니다. 설명된 접근법은 새로 생성된 항체에 적용가능하며 종양/장기 분포 특성에 대한 임상적으로 효과적인 항체(원하는 자질)와…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 버지니아 대학 암 센터 핵심 이미징 시설, 생체 분자 분석 시설, 고급 현미경 검사시설 및 핵심 Vivarium 지원에 감사드립니다. J. T-S는 난소암 아카데미 (OCA-DoD)의 초기 경력 조사자입니다. 이 작품은 J. T-S, 미국 DoD 유방암 연구 프로그램 (BCRP)에 NCI / NIH 보조금 (R01CA233752)에 의해 지원되었다 J. T-S (BC17097) 및 미국 DoD 난소암 연구 프로그램 (OCRP) 자금 지원 상 (OC180412) J-S.J.
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
