組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成
Summary
任意の与えられた低分子リガンドに対して所望の親和性および特異性を有する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを作成することは、多くの生物学的センシングおよび作動アプリケーションを有するであろう。ここでは、ファージディスプレイコンビナトリアル単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的選択を介した化学的に誘導された二量体化システムのde novoエンジニアリングのための効率的で一般化可能な方法について説明する。
Abstract
低分子リガンドの存在下でのみ発生するタンパク質二量体化イベントは、生物学的経路の解剖および操作のための低分子バイオセンサの開発を可能にする。現在、化学的に誘導された二量体化(CID)システムは限られており、特定の低分子リガンドに対して所望の感度と選択性を有する新しいシステムをエンジニアリングすることが、タンパク質工学の分野では依然として課題となっています。ここでは、多種多様なリガンドに適用可能なCIDシステムのデノボエンジニアリングに対する、CID(COMBINES-CID)の高スループットスクリーニング方法について説明します。この方法は、ファージディスプレイされたコンビナトリアルnanobodyライブラリの2段階選択を使用して、最初に目的のリガンドに結合する1)「アンカーバインダー」を取得し、次に2)アンカーバインダー-リガンド複合体にのみ結合する「二量体化バインダー」を得る。アンカーバインダーを選択するには、109以上の相補性決定領域(CDR)ランダム化ナノボディのコンビナトリアルライブラリーをビオチン化リガンドでスクリーニングし、バイオ層干渉法(BLI)によって標識されていないリガンドでヒットを検証する。二量体化バインダーを得るために、nanobodyライブラリは、陽性スクリーニングの標的としてアンカーバインダー-リガンド複合体、および負のスクリーニングのための非結合アンカーバインダーでスクリーニングされる。COMBINES-CIDは、他の免疫グロブリン、非免疫グロブリン、または計算的に設計された足場を持つCID結合剤を選択して、薬物、代謝産物、シグナル伝達分子などのインビトロおよびインビボ検出用のバイオセンサーを作成するために広く適用可能です。
Introduction
CIDシステムは、2つのタンパク質が低分子リガンドの存在下でのみ二量体化する(図1)、代謝、シグナル伝達、および他の生物学的経路1を解剖および操作するための多目的なツールを提供する。彼らは、養子T細胞療法の安全性および有効性を改善するための薬物制御T細胞活性化2およびアポトーシス3、4などの生物学的作動における可能性を実証した。さらに、それらは生体内または低分子標的のインビトロ検出のための新しい方法論を提供する。例えば、CIDタンパク質は、インビボ測定のために蛍光レポーター系(例えば、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)5および円形透過蛍光タンパク質)6と遺伝的に融合することができ、またはサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)様アッセイのアフィニティー試薬として機能する。
幅広い用途にも関わらず、与えられた低分子リガンドで制御できる新しいCIDシステムの作成には大きな課題があります。動物免疫7、invitro選択8、9、および計算タンパク質設計10を含む確立されたタンパク質結合剤工学方法は、バイナリタンパク質リガンド相互作用を介して機能するリガンド結合タンパク質を生成することができる。しかしながら、これらの方法は、リガンド誘発三次CID複合体を作成するのが困難である。いくつかの方法は、同じまたは異なるタンパク質11、12、13、14、15、16に独立して結合する2つのリガンドを化学的に連結することによってCIDを作成するか、または既存の小分子タンパク質複合体17、18を標的とする抗体などの結合剤タンパク質の選択に依存し、したがってリガンドの選択が限られている。
我々は最近、CIDシステム19のデノボエンジニアリングのためのCID(COMBINES-CID)法の選挙をナビゲートするコムバイナリビンデルスを開発しました。この方法は、リガンド誘発二量体化の高い特異性(例えば、アンカー二量体化バインダー解離定数、KD(リガンドなし)/KD(リガンド付き)>1,000)を得ることができる。二量体化特異性は、リガンド結合時に立体構造変化を引き起こす可能性のある柔軟な結合部位を有するアンカーバインダーを使用して達成され、リガンド結合アンカーバインダーのみを認識する立体構造選択的結合剤の選択の基礎を提供する。ナノボディのカンナビジオール(CBD)誘導ヘテロダイマー、ユニバーサル足場と3つの柔軟なCDRループを含むラクダ由来の12〜15kDa機能性抗体断片(図2)20を作成することにより、原理証明を実証した。特に、同じ高品質ライブラリを異なるリガンドに適用できるため、コンビナトリアルタンパク質ライブラリのin vitro選択は、CIDエンジニアリングにとって費用対効果が高く、一般化可能である必要があります。
このプロトコルとビデオでは、CBDをターゲットとして109より高い多様性を持つコンビナトリアル・ナノーネライブラリーをスクリーニングすることにより、アンカー(図3A)と二量体化バインダー(図3B)の2段階のインビトロ選択と検証について説明することに焦点を当てていますが、プロトコルは他のタンパク質ライブラリまたは小分子ターゲットに適用可能である必要があります。CIDバインダーのスクリーニングには通常6~10週間かかります(図4)。
Protocol
Representative Results
Discussion
バイオパンニングの異なるラウンドのための入力ファージライブラリの正しい濃度を選択することが重要です。通常、多様性を持つ ~1012~1013ファージ粒子の入力ライブラリから開始し、各ファージクローンの約 100 ~ 1,000 コピーをプルダウン アッセイで提示できます。結合アッセイ中のファージ濃度が高すぎるか低すぎると、非特異的結合または陽性クローンの喪失の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ワシントン大学イノベーション賞(L.G.へ)、米国国立衛生研究所(1R35GM128918からL.G.)からの助成金、ワシントン大学のスタートアップファンド(L.G.へ)によって支援されました。H.J.はワシントン研究財団の学部フェローシップの支援を受けています。K.W.はワシントン大学タンパク質デザイン研究所の学部フェローシップに支えられました。
Materials
| 1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
| BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
| CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
| FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
| HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
| Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
| M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
| Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
| Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
| pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
| PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
| Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
| Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
| SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
| Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
| Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
| TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |
References
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