Generation av Mosaic Mammary Organoids av differentialtrypsinization
Summary
Bröstkörteln är en dubbelskiktad struktur, bestående av yttre myoepiteloch inre luminala epitelceller. Presenteras är ett protokoll för att förbereda organoider med hjälp av differentiell trypsinization. Denna effektiva metod gör det möjligt för forskare att separat manipulera dessa två celltyper för att undersöka frågor om deras roller i bröstkörtel form och funktion.
Abstract
Organoider erbjuder självorganiserande, tredimensionella vävnadsstrukturer som sammanfattar fysiologiska processer i bekvämligheten av en maträtt. Murine bröstkörteln består av två distinkta epitelcellfack, som betjänar olika funktioner: den yttre, contractile myoepithelial facket och den inre, sekretoriska luminal fack. Här beskriver vi en metod genom vilken de celler som består av dessa avdelningar isoleras och sedan kombineras för att undersöka deras individuella härstamning bidrag till bröstkörtel morfogenes och differentiering. Metoden är enkel och effektiv och kräver inte sofistikeradseparationsteknik som fluorescensaktiverad cellsortering. Istället skördar vi och enzymatically smälta vävnaden, utsäde epitelet på vidhäftande vävnad kulturrätter, och sedan använda differentiell trypsinization att skilja myoepithelial från luminala celler med ~ 90% renhet. Cellerna pläteras sedan i en extracellulär matris där de organiserar sig i tvåskiktade, tredimensionella (3D) organoider som kan differentieras för att producera mjölk efter 10 dagar i kultur. För att testa effekterna av genetiska mutationer kan celler skördas från vilda typer eller genetiskt modifierade musmodeller, eller de kan manipuleras genetiskt före 3D-kultur. Denna teknik kan användas för att generera mosaik organoider som möjliggör undersökning av genfunktion specifikt i luminal eller myoepiteldel.
Introduction
Bröstkörteln (MG) är en trädliknande, rörformig epitelstruktur inbäddad i en adipocyte rik stroma. Det tvåskiktade segepitel består av ett yttre, basalt lager av kontraktien, myoepithelial celler (MyoECs) och ett inre lager av luminala, sekretoriska epitelceller (LECs), omger en central lumen1. Under amning när de yttre MyoECs kontrakt att pressa mjölk från den inre alveolar LECs, mg genomgår många förändringar som är under kontroll av tillväxtfaktorer (t.ex. EGF och FGF) och hormoner (t.ex. progesteron, insulin och prolaktin). Dessa förändringar orsakar differentiering av specialiserade strukturer, alveoli, som syntetiserar och utsöndrar mjölk under amning1. Den bröst epitel kan experimentellt manipuleras med hjälp av tekniker där antingen epitelvävnad fragment, celler, eller ens en enda basala cell transplanteras till värd bröst fett kuddar, precleared av endogena bröst parenkym, och får växa ut för att rekonstruera en hel, funktionell epitelträd2,3,4,5. Transplantation är en kraftfull teknik, men det är tidskrävande och omöjligt om en mutation resulterar i tidig embryonal dödlighet (före E14) som förhindrar räddning av transplanterbar bröstanlage. Dessutom vill utredarna ofta undersöka rollerna för de två olika avdelningarna, som härrör från härstamningsbegränsade stamceller. Medan Cre-lox-tekniken möjliggör differentiell genetisk manipulering av MyoECs och LECs, är detta också ett tidskrävande och dyrt företag. Således, sedan 1950-talet, utredare har använt in vitro däggdjur organoider som ett relativt enkelt och effektivt sätt att ta itu med frågor om bröstvävnad struktur och funktion6,7.
I tidiga protokoll som beskriver isolering och kultur av primära däggdjur epitelceller, fann utredarna att en källare membran matris (BME), bestående av en plasma propp och kyckling embryo extrakt, krävdes för MG fragment som odlas på en maträtt6. Under de följande decennierna, extracellulära matriser (ECMs, kollagen, och jellylike protein matris utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkom celler) utvecklades för att underlätta 3D-kultur och bättre efterlikna in vivo miljö7,8,9,10. Kulerande celler i 3D-matriser avslöjas av flera kriterier (morfologi, genuttryck, och hormon lyhördhet) att en sådan mikromiljö bättre modeller in vivo fysiologiska processer9,10,11,12. Forskning med hjälp av primära murineceller identifierade viktiga tillväxtfaktorer och morggör som är nödvändiga för utökat underhåll och differentiering av organoider13. Dessa studier har satt grunden för det protokoll som presenteras här, och för kulturen av mänskliga bröstceller som 3D-organoider, som nu är ett modernt kliniskt verktyg, vilket möjliggör läkemedelsupptäckt och drogtester på patientprover14. Sammantaget belyser organoid odling självorganisering kapacitet primära celler och deras bidrag till morfogenes och differentiering.
Presenteras här är ett protokoll till kultur murine epithelia som kan differentieras till mjölkproducerande acini. En differentialtrypsinization-teknik används för att isolera de MyoECs och LECs som utgör de två distinkta MG-cellfacken. Dessa separerade cellfraktioner kan sedan manipuleras genetiskt till överexpress eller knockdown genfunktion. Eftersom härstamning-inneboende, egenorganisation är en medfödd egenskap av bröst epitelceller15,16,17, recombining dessa cell fraktioner tillåter forskare att generera tvåskiktade, mosaik organoider. Vi börjar med att enzymatically smälta fettvävnaden, och sedan inkubera bröstfragmentpå en vävnad kultur skålen för 24 h (Figur 1). Vävnadsfragmenten sätter sig på polystyrenrätter som tvåskiktade fragment med sin in vivo-organisation: yttre myoepiteliska skikt kring inre luminala lager. Denna cellulära organisation möjliggör isolering av de yttre MyoECs av trypsin-EDTA (0,05%) behandling i 3-6 min följt av en andra omgång trypsin-EDTA (0,05%) behandling som lossnar de återstående inre lysdioderna(figur 2). Således är dessa celltyper med olika trypsinkänslighet isolerade och kan därefter blandas och pläteras i ECM (figur 3). Cellerna genomgår självorganisering för att bilda tvåskiktade sfärer, bestående av ett yttre lager av MyoECs kring inre LYSOK. Lumen bildning uppstår som cellerna växer i ett medium som innehåller en cocktail av tillväxtfaktorer (se recept för Growth Medium)13. Efter 5 dagar kan organoider differentieras till mjölkproducerande acini genom att byta till Alveologenesis Medium (se recept och figur 3F) och inkuberas i ytterligare 5 dagar. Alternativt kommer organoider att fortsätta att expandera och förgrena sig i Growth Medium i minst 10 dagar. Organoider kan analyseras med hjälp av immunofluorescens (figur 3D-F) eller frigörs från ECM med hjälp av en återhämtningslösning (se innehållsförteckning)och analyseras via andra metoder (t.ex. immunoblot, RT-qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenteras en metod med uppgifter om hur forskare kan generera 3D-organoidkulturer med hjälp av primära MG-celler. Skillnaden mellan detta och andra protokoll är att vi detalj en metod för att separera de två, distinkta MG cell fack: den yttre basala MyoECs och inre LYSKLAR. Vår metod använder en tvåstegs trypsin-EDTA (0,05%) behandling som vi kallar differentialtrypsinization19. Detta förfarande gör det möjligt för forskare att isolera MyoECs och LYSOK utan att använda sofistik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Ben Abrams för tekniskt bistånd och kärnstöd från University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for the Biology of Stem Cells (IBSC). Vi tackar Susan Strome och Bill Saxton för användningen av deras Solamere Spinning Disk Confocal Mikroskop. Detta arbete stöddes delvis av bidrag till UCSC från Howard Hughes Medical Institute genom James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (S.R.), från NIH (NIH GM058903) för initiativet att maximera studentutveckling (H.M.) och från National Science Foundation för forskarstipendium (O.C. DGE 1339067) och genom bidrag (A18-0370) från UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
References
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. 발생학. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O’Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
