Kvantifiering av etanolnivåer i zebrafiskembryon med hjälp av kromator
Summary
Detta arbete beskriver ett protokoll för att kvantifiera etanolnivåer i ett zebrafiskembryo med hjälp av gaskromatografi för huvudutrymmen från lämpliga exponeringsmetoder för embryobearbetning och etanolanalys.
Abstract
Fetala alkoholspektrumstörningar (FASD) beskriver ett mycket varierande kontinuum av etanolinducerade utvecklingsdefekter, inklusive ansiktsdysmorfoser och neurologiska funktionsnedsättningar. Med en komplex patologi drabbar FASD cirka 1 av 100 barn födda i USA varje år. På grund av fasds mycket varierande karaktär har djurmodeller visat sig vara avgörande i vår nuvarande mekanistiska förståelse av etanolinducerade utvecklingsdefekter. Allt fler laboratorier har fokuserat på att använda zebrafisk för att undersöka etanolinducerade utvecklingsdefekter. Zebrafisk producerar ett stort antal externt befruktade, genetiskt ursåtbara, genomskinliga embryon. Detta gör det möjligt för forskare att exakt kontrollera timing och dosering av etanol exponering i flera genetiska sammanhang och kvantifiera effekterna av embryonal etanol exponering genom levande bildframställning tekniker. Detta, i kombination med den höga graden av bevarande av både genetik och utveckling med människor, har visat zebrafisk vara en kraftfull modell för att studera den mekanistiska grunden för etanol teratogenicitet. Etanolexponeringsregimer har dock varierat mellan olika zebrafiskstudier, som har förvirrat tolkningen av zebrafiskdata i dessa studier. Här är ett protokoll för att kvantifiera etanol koncentrationer i zebrafisk embryon med hjälp av huvudet utrymme gaskromatografi.
Introduction
Fetala alkoholspektrumstörningar (FASD) beskriver ett brett spektrum av neurologiska funktionsnedsättningar och kraniofacial dysmorphologies i samband med embryonal etanol exponering1. Flera faktorer, inklusive timing och dosering av etanolexponering och genetisk bakgrund, bidrar till variationen av FASD2,3. Hos människor gör det komplexa förhållandet mellan dessa variabler att studera och förstå etiologin för FASD utmanande. Djurmodeller har visat sig vara avgörande för att utveckla vår förståelse av den mekanistiska grunden för etanolteratogenicitet. Ett brett utbud av djurmodellsystem har använts för att studera flera aspekter av FASD och resultaten har varit anmärkningsvärt förenliga med vad som finns i exponering hos människor4. Gnagare modellsystem används för att undersöka många aspekter av FASD, med möss är den vanligaste5,6,7. Majoriteten av detta arbete har fokuserat på utvecklingsdefekter till tidig etanolexponering8, men senare exponering för etanol har visat sig orsaka utvecklingsavvikelser samt9. Dessutom har mössens genetiska förmåga i hög grad hjälpt till i vår förmåga att undersöka den genetiska grunden för FASD10,11. Dessa studier på möss tyder starkt på att det finns genetanol interaktioner med sonic igelkott en väg, retinoinsyra signalering, Superoxid dismutase, kväveoxid syntas I, Aldh2 och Fancd28,10,11, 12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Dessa studier visar att djurmodeller är avgörande för att främja vår förståelse av FASD och dess underliggande mekanismer.
Zebrafisken har vuxit fram som ett kraftfullt modellsystem för att undersöka många aspekter av etanol teratogenes22,23. På grund av deras externa befruktning, hög fruktbarhet, genetiska tarmeffekter och levande bildförmåga, zebrafisk är idealiska för studier faktorer såsom timing, dosering, och genetik etanol teratogenes. Etanol kan administreras till exakt iscensatta embryon och embryona kan sedan avbildas för att undersöka etanolens direkta effekter under utvecklingsprocesser. Detta arbete kan relateras direkt till människor, eftersom de genetiska utvecklingsprogrammen är mycket bevarade mellan zebrafiskar och människor och kan därför hjälpa till att vägleda FASD mänskliga studier24. Medan zebrafisk har använts för att undersöka etanol teratogenes, en brist på samförstånd i rapporteringembryonaletanol koncentrationer gör jämförelse med människor svårt25. I däggdjurssystem korrelerar alkoholhalten i blodet direkt till vävnadsetanolnivåer26. Många av zebrafiskstudierna behandlar embryon innan de slutför bildandet av deras cirkulationssystem. Utan ett mödraprov att undersöka krävs en process för att bedöma etanolkoncentrationer för att kvantifiera etanolnivåerna inom embryot. Här beskriver vi en process för att kvantifiera etanolkoncentrationer i ett växande zebrafiskembryo med hjälp av gaskromatografi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som utvecklingsmodellsystem är zebrafisk idealisk för att studera miljöfaktorers inverkan på utvecklingen. De producerar ett stort antal externt befruktade embryon, vilket möjliggör exakt timing och dosering paradigm i etanol studier. Detta, i kombination med levande bildbehandling kapacitet och den genetiska och utvecklingsmässiga bevarande med människor, gör zebrafisk ett kraftfullt modellsystem för teratologi studier. Beskrivs är ett protokoll för att mäta embryonala etanolkoncentrationer för att utveckl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den forskning som presenteras i denna artikel stöddes av tidigare bidrag från National Institutes of Health / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 till J.K.E. och National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. and by the current grant from National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Vi tackar Rueben Gonzales för att de tillhandahåller och hjälper till med analys av gaskromatograf. Vi tackar Tiahna Ontiveros och Dr Gina Nobles skriva hjälp.
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
References
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol’s molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. 발생학. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
