Kvantificering af ethanolniveauer i zebrafiskembryoner ved hjælp af head space gaskromatografi
Summary
Dette arbejde beskriver en protokol til kvantificering af ethanolniveauer i et zebrafiskfoster ved hjælp af gaskromatografi til hovedrum fra korrekt eksponeringsmetoder til embryobehandling og ethanolanalyse.
Abstract
Føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) beskriver et meget varierende kontinuum af ethanol-inducerede udviklingsdefekter, herunder ansigtsdysmorfoster og neurologiske funktionsnedsættelser. Med en kompleks patologi påvirker FASD ca. 1 ud af 100 børn født i USA hvert år. På grund af FASD’s meget variable karakter har dyremodeller vist sig at være kritiske i vores nuværende mekanistiske forståelse af ethanolinducerede udviklingsfejl. Et stigende antal laboratorier har fokuseret på at bruge zebrafisk til at undersøge ethanol-inducerede udviklingsfejl. Zebrafisk producerer et stort antal eksternt befrugtede, genetisk tractable, gennemskinnelige embryoner. Dette gør det muligt for forskere præcist at kontrollere timingen og doseringen af ethanoleksponering i flere genetiske sammenhænge og kvantificere virkningen af embryonal ethanoleksponering gennem levende billeddannelsesteknikker. Dette, kombineret med den høje grad af bevarelse af både genetik og udvikling med mennesker, har vist zebrafisk at være en kraftfuld model til at studere det mekanistiske grundlag for ethanol teratogenicity. Ethanoleksponeringsregimer har imidlertid varieret mellem forskellige zebrafiskundersøgelser, hvilket har forvirret fortolkningen af zebrafiskdata på tværs af disse undersøgelser. Her er en protokol til kvantificering af ethanolkoncentrationer i zebrafiskembryoner ved hjælp af hovedrumsgaskromatografi.
Introduction
Føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) beskriver en bred vifte af neurologiske funktionsnedsættelser og kraniofacialdysmorphologier forbundet med embryonal ethanol eksponering1. Flere faktorer, herunder timing og dosering af ethanol eksponering og genetisk baggrund, bidrage til variationen af FASD2,3. Hos mennesker, gør det komplekse forhold mellem disse variabler studere og forstå ætiologi FASD udfordrende. Dyremodeller har vist sig afgørende for at udvikle vores forståelse af det mekanistiske grundlag for ethanolteratogenicityitet. En bred vifte af dyremodelsystemer er blevet brugt til at undersøge flere aspekter af FASD, og resultaterne har været bemærkelsesværdigt i overensstemmelse med, hvad der findes i eksponering hos mennesker4. Gnaver modelsystemer bruges til at undersøge mange aspekter af FASD, med mus er den mest almindelige5,6,7. Størstedelen af dette arbejde har fokuseret på udviklingsfejl ved tidlig eksponering af ethanol8, selvom det senere har vist sig at være udsat for ethanol . Desuden har de genetiske evner mus i høj grad hjulpet i vores evne til at sonde den genetiske fundament af FASD10,11. Disse undersøgelser i mus tyder stærkt på, at der er gen-ethanol interaktioner med den soniske pindsvin vej, retinsyre signalering, Superoxid dismutase, nitrogenoxid syntase Jeg, Aldh2 og Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Disse undersøgelser viser, at dyremodeller er afgørende for at fremme vores forståelse af FASD og dets underliggende mekanismer.
Zebrafisken har vist sig som et kraftfuldt modelsystem til at undersøge mange aspekter af ethanol teratorene22,23. På grund af deres eksterne befrugtning, høj frugtbarhed, genetisk tractability, og levende billeddannelse kapaciteter, zebrafisk er velegnet til at studere faktorer såsom timing, dosering, og genetik af ethanol teratogenese. Ethanol kan administreres til præcist iscenesatte embryoner, og embryonerne kan derefter afbildes for at undersøge ethanolens direkte virkning under udviklingsprocesser. Dette arbejde kan relateres direkte til mennesker, fordi de genetiske programmer for udvikling er stærkt bevaret mellem zebrafisk og mennesker og kan derfor hjælpe guide FASD menneskelige undersøgelser24. Mens zebrafisk er blevet brugt til at undersøge ethanol terateseene, en mangel på konsensus i rapportering embryonale ethanol koncentrationer gør sammenligning med mennesker vanskeligt25. I pattedyrsystemer, blod-alkohol niveauer korrelerer direkte til væv ethanol niveauer26. Mange af zebrafiskundersøgelserne behandler embryoner før fuldstændig dannelse af deres kredsløbssystem. Uden nogen moderprøve at undersøge, en proces til vurdering af ethanol koncentrationer er nødvendig for at kvantificere ethanol niveauer i fosteret. Her beskriver vi en proces til kvantificering af ethanolkoncentrationer i et udviklende zebrafiskembryon ved hjælp af hovedrumsgaskromatografi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som et udviklingsmodelsystem er zebrafisk velegnet til at undersøge miljøfaktorernes indvirkning på udviklingen. De producerer et stort antal eksternt befrugtede embryoner, som giver mulighed for præcis timing og dosering paradigmer i ethanol undersøgelser. Dette, kombineret med live imaging kapaciteter og den genetiske og udviklingsmæssige bevarelse med mennesker, gør zebrafisk en kraftfuld model system til teratologi undersøgelser. Beskrevet er en protokol til måling af embryonale ethanolkoncentrationer i udvi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den forskning, der præsenteres i denne artikel blev støttet af tidligere tilskud fra National Institutes of Health / National Institute of Dental og Craniofacial Research (NIH / NIDCR) R01DE020884 til JK og National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 til C.B.L. og af det nuværende tilskud fra National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 til C.B.L. Vi takker Rueben Gonzales for at levere og bistå med gas kromatograf analyse. Vi takker Tiahna Ontiveros og Dr. Gina Nobles skrive bistand.
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
References
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol’s molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. 발생학. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
