Quantificação dos níveis de etanol em embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça
Summary
Este trabalho descreve um protocolo para quantificar os níveis de etanol em um embrião de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça de métodos de exposição adequados ao processamento de embriões e análise de etanol.
Abstract
Distúrbios do Espectro Alcoólica Fetal (FASD) descrevem um contínuo altamente variável de defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol, incluindo dismorfiologias faciais e prejuízos neurológicos. Com uma patologia complexa, a FASD afeta aproximadamente 1 em cada 100 crianças nascidas nos Estados Unidos a cada ano. Devido à natureza altamente variável da FASD, os modelos animais têm se mostrado críticos em nossa compreensão mecanicista atual de defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol. Um número crescente de laboratórios se concentrou no uso de zebrafish para examinar defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol. Os zebrafish produzem um grande número de embriões fertilizados externamente, geneticamente tráteis e translúcidos. Isso permite que os pesquisadores controlem precisamente o tempo e a dosagem da exposição ao etanol em múltiplos contextos genéticos e quantifiquem o impacto da exposição embrionária do etanol por meio de técnicas de imagem ao vivo. Isso, combinado com o alto grau de conservação da genética e do desenvolvimento com humanos, provou que os zebrafish são um modelo poderoso para estudar a base mecanicista da teratogenicidade do etanol. No entanto, os regimes de exposição ao etanol variaram entre diferentes estudos de zebrafish, o que confundiu a interpretação dos dados de zebrafish nesses estudos. Aqui está um protocolo para quantificar as concentrações de etanol em embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça.
Introduction
Os Distúrbios do Espectro Alcoólica Fetal (FASD) descrevem uma ampla gama de deficiências neurológicas e dismorfimias craniofaciais associadas à exposição embrionária do etanol1. Múltiplos fatores, incluindo tempo e dosagem de exposição ao etanol e fundo genético, contribuem para a variação do FASD2,3. Em humanos, a complexa relação dessas variáveis torna o estudo e a compreensão da etiologia do FASD desafiador. Os modelos animais têm se mostrado cruciais no desenvolvimento da nossa compreensão da base mecanicista da teratogenicidade do etanol. Uma grande variedade de sistemas de modelos animais tem sido usada para estudar múltiplos aspectos do FASD e os resultados têm sido notavelmente consistentes com o que é encontrado em exposição em humanos4. Os sistemas de modelos de roedores são usados para examinar muitos aspectos do FASD, sendo os camundongos os mais comuns5,6,7. A maior parte deste trabalho tem se concentrado em defeitos de desenvolvimento para a exposição precoce do etanol8, embora a exposição posterior ao etanol tenha sido demonstrada para causar anomalias de desenvolvimento também9. Além disso, as capacidades genéticas dos camundongos ajudaram muito em nossa capacidade de sondar os fundamentos genéticos do FASD10,11. Esses estudos em camundongos sugerem fortemente que existem interações gene-etanol com a via sônica de ouriço, sinalização de ácido retinóico, dismutase de superóxido, óxido nítrico sintetizador I, Aldh2 e Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Esses estudos mostram que os modelos animais são fundamentais para avançar em nossa compreensão da FASD e seus mecanismos subjacentes.
O zebrafish emergiu como um poderoso sistema modelo para examinar muitos aspectos da teratogênese do etanol22,23. Devido à sua fertilização externa, alta fecundidade, tratério genético e capacidades de imagem ao vivo, os zebrafish são idealmente adequados para estudar fatores como tempo, dosagem e genética da teratogênese do etanol. O etanol pode ser administrado a embriões precisamente encenados e os embriões podem então ser imagem para examinar o impacto direto do etanol durante os processos de desenvolvimento. Este trabalho pode estar relacionado diretamente aos seres humanos, pois os programas genéticos de desenvolvimento são altamente conservados entre zebrafish e humanos e, portanto, podem ajudar a orientar os estudos humanos da FASD24. Embora os zebrafish tenham sido usados para examinar a teratogênese do etanol, a falta de consenso em relatar concentrações embrionárias de etanol torna difícil a comparação com os humanos25. Nos sistemas de mamíferos, os níveis de álcool no sangue correlacionam-se diretamente aos níveis de etanol tecidual26. Muitos dos estudos de zebrafish tratam embriões antes da formação completa de seu sistema circulatório. Sem amostra materna para examinar, é necessário um processo para avaliar as concentrações de etanol para quantificar os níveis de etanol dentro do embrião. Aqui descrevemos um processo para quantificar as concentrações de etanol em um embrião de zebrafish em desenvolvimento usando cromatografia de gás espacial da cabeça.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como um sistema modelo de desenvolvimento, os zebrafish são idealmente adequados para estudar o impacto dos fatores ambientais no desenvolvimento. Eles produzem um grande número de embriões fertilizados externamente, o que permite paradigmas precisos de tempo e dosagem em estudos de etanol. Isso, combinado com as capacidades de imagem ao vivo e a conservação genética e de desenvolvimento com humanos, faz do zebrafish um poderoso sistema modelo para estudos de teratologia. Descrito é um protocolo para medir as conc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa apresentada neste artigo foi apoiada por subvenções anteriores dos Institutos Nacionais de Saúde/Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (NIH/NIDCR) R01DE0208884 para J.K.E. e InstitutoNacional de Saúde/Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo (NIH/NIAAA) F32AA021320 para C.B.L. e pela atual subvenção dos Institutos Nacionais de Saúde/Instituto Nacional de Abuso de Álcool (NIH/NIAAA) R00AA023560 para C.B.L. Agradecemos a Rueben Gonzales por fornecer e ajudar na análise do cromatógrafo a gás. Agradecemos a Tiahna Ontiveros e à Dra.
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
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