כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.
בערוץ המכונה (MET) מפעיל השער ממלא תפקיד חשוב בשמיעה. עם זאת, הזהות המולקולרית והמידע המבני של MET אינם ידועים. המחקרים האלקטרופיסיולוגיים של תאי השיער גילו שלערוץ MET יש היקף מוליכות גדול והוא חדיר למולקולות פלורסנט גדולות יחסית, כולל מספר צבעים בצבעי styryl ואנטיביוטיקה בצבע אדום עם התווית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה להמחיש ולהעריך את ספיגת דטרנס פלורסנט בתאי השיער של האיבר של האקריות Corti שניתן להשתמש בו כדי לטפל עבור הערוצים הפונקציונליים MET. מצאנו כי 3 kda טקסס אדום תווית תוספי במיוחד תוויות שיער שמיעתי פונקציונלי לאחר 1 – 2 h הדגירה. בפרט, 3 kda תוספי תוויות שתי שורות stereocilia קצר מצטבר בגוף התא בתבנית מפוזר כאשר ערוצי MET פונקציונלי נוכחים. דפוס נוסף שלפוחית העין של תיוג נצפתה בגוף התא של תאי השיער והתאים התומכים המקיפים. הנתונים שלנו מראים כי 3 kda טקסס-אדום תוספי ניתן להשתמש כדי להמחיש וללמוד שני מסלולים עבור ספיגת צבע הסלולר; מסלול כניסה ספציפי לתא שיער באמצעות ערוצי MET פונקציונלי והאנדוציטוזה, דפוס זמין גם dextran גדול.
תאי השיער של האוזן הפנימית הם תאי החישה המזהים קול וסמויה את הגירוי המוכני באותות חשמליים, אשר מפורשים בסופו של דבר על ידי המוח שלנו. תאים אלה יש צרור בצורת גרם מדרגות של שלוש שורות של filaments מבוססי חוטים, המכונה stereocilia, אשר בולטות מאזור פסגה שלהם1,2. הגירוי המכני מהסיט את החוטים הסטריאוציאניים לעבר השורה הארוכה ביותר ומפעיל את פתיחת ערוצי המכונה3. פתיחת ערוצי ה-MET מובילה לזרם של הקטיונים המפתלים את התא וכתוצאה מכך מאותת על שחרורו של סינפסה באזור הבסיס של תא השיער.
המאפיינים הביופיזיים של ערוץ MET חיוני לשמיעה התאפיין בהרחבה. בין היתר, הערוצים הללו הם בררניים ובעלי מוליכות גדולה יחסית (150 – 300 pS ב-Ca+ 2 +)4,5,6,7,8,9,10. באופן מדהים, מולקולות פלורסנט גדול כגון FM1-43 ו-טקסס בעלת תווית של האדום מתויג של הערוץ ה, הנובע הצטברות שלהם בגוף תא השיער שניתן לדמיין באמצעות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית11,12,13,14. לעומת זאת, הזהות המולקולרית ומבנה ערוץ ה-MET ומסלול החדירות שלו נותרו חמקמקים. הגדלת הראיות הנסיוניות מצביעה על כך שחלבון הערוץ ה-transרפידה (TMC1) הוא רכיב של ערוץ ה-MET בתאי שיער בוגרים15,16,17,18,19. מוטציות בערוץ מדומה (TMC1) לשנות את מאפייני ערוץ MET19,20,21,22 ולגרום חירשות. בנוסף, TMC1 לאתר את ערוץ met18,23 ואינטראקציה עם הקישור טיפ אחראי על שידור הכוח המכני לערוץ MET24,25. יתר על כן, ניתוח ביואינפורמטיקה האחרונים זיהה את החלבונים tmc כמו האבולוציה הקשורים לערוצים מכנימתי TMEM63/osca חלבונים וחלבונים TMEM16, משפחה של ערוצי כלוריד סידן מופעל ו ליפידים26,27,28. מודל מבנית של TMC1 מבוסס על הקשר בין חלבונים אלה חשף נוכחות של חלל גדול בממשק חלבון-שומנים ממשק27. זה חלל הנמלים שתי מוטציות TMC1 שגורמות לאובדן שמיעה אוטוזומלית דומיננטי (DFNA36)27,29,30,31,32, ושינוי סלקטיבי של מוטציות ציסטאין עבור שאריות בחלל לשנות את המאפיינים של הערוץ28, המציין כי זה יכול לתפקד כנתיב חדירות של ערוץ MET. הגודל הגדול של חלל זה ניבא בחלבונים TMC יכול להסביר את היכולת של מולקולות גדולות לחלחל ערוץ MET. כדי לבדוק את החיזוי כי הערוץ MET מכיל מסלול חדירות גדול במיוחד כדי לדחוף את המגבלות של גודל החלל נצפתה ב TMC1, פיתחנו פרוטוקול לבצע ניסויים ספיגה באיבר של האקסון corti עם מולקולה גדולה יותר, 3 הודה תוספי באופן שכותרתו עם טקסס אדום.
Dextran הוא רב-סוכר מורכב בענף מורכב של מולקולות D-גלוקוז רבות כרוך על ידי alpha-1, 6 הקשרים הגליצידית. שלה מסיסות גבוהה במים, רעילות תא נמוכה, ו bioinertity להפוך אותו כלי רב-תכליתי ללמוד מספר תהליכים סלולריים. בנוסף, תוספי זמין במגוון רחב של גדלים ובעלי תווית fluorophores של מספר צבעים. בדרך כלל, משתמשים ב-dextrans באמצעות מחקר של תאים וחדירות רקמות33,34, כדי ללמוד אנדוקציטוזה במערכות סלולריות מרובות35,36, ועבור מעקב עצבי37,38. בשדה השמיעה, מולקולות תוספי גם נעשה שימוש כדי להעריך את ההפרעה של הצומת תא תא ואובדן של שלמות האפיתל חושי השמיעה לאחר החשיפה לרעש אינטנסיבי בעוגב צ’ינצ’ילה של corti39,40.
בעבודה זו, אנו לנצל את המאפיינים של חלק קטן (3 ו-10 kDa) הפלורסנט כדי לבצע ניסויים ספיגה בתאי שיער פנימי murine ולחקור את הגודל של הנתיב חדירות של תא האוזן הפנימית שיער פוגש ערוץ. בנוסף, השתמשנו מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בדיקת לייזר (lsm) 880 מצויד בגלאי airyscan כדי להמחיש ולהתאים את תוספי פלורסנט ב stereocilia ואת גוף התא של תאים שיער שמיעתי.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניסויים ספיגה באיבר murine של האקסוצמחים corti עם 3 kda תוספי טקסס אדום. המטרה של שיטה זו היא לבדוק אם מולקולות גדולות יותר מאשר אחרים שנבדקו בעבר היו גם מסוגלים לתייג במפורש תאים שיער שמיעתי והחדיר דרך ערוץ MET. פרוטוקולים ניסיוניים דומים שימשו בעבר כדי להעריך את החדירות…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לוינסנט Schram מתוך המיקרוסקופיה וליבת ההדמיה לסיוע ברכישת תמונה מרכזית, ו-Tsg-Hui Chang לעזרה לא יסולא בפז בניהול המושבה ובטיפול בעכברים. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של NINDS, NIH, בת, MD, כדי K.J.S. א יהושע נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של NINDS, NIH, ועל ידי רוברט Wenthold מלגת השתלמות מתוכנית המחקר התוך-קיר של ה-נדבך.
#1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |