OaAEP1-medierad enzymatisk syntes och immobilisering av polymeriserat protein för enmolekylkraftsspektroskopi

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att konjugera proteinmonomer av enzymer som bildar proteinpolymer med en kontrollerad sekvens och immobilisera den på ytan för enmolekylkraft spektroskopi studier.

Abstract

Kemiska och biokonjugationstekniker har utvecklats snabbt under de senaste åren och möjliggöra byggande av proteinpolymerer. En kontrollerad proteinpolymeriseringsprocess är dock alltid en utmaning. Här har vi utvecklat en enzymatisk metod för att konstruera polymererat protein steg för steg i en rationellt kontrollerad sekvens. I denna metod är C-ändstationen för en proteinmonomer NGL för proteinkonjugering med OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginylendopeptidaser) 1) medan N-ändstationen var en cleavable TEV (tobak etsvirus) klyvning webbplats plus en L (ENLYFQ/GL) för tillfällig N-terminal skydd. Därför kunde OaAEP1 lägga till endast en proteinmonomer i taget, och sedan TEV proteask klynade N-ändstationen mellan Q och G för att exponera NH₂-Gly-Leu. Då är enheten klar för nästa OaAEP1 ligering. Det konstruerade polyproteinet undersöks genom att utveckla enskilda proteindomän med hjälp av atomkraftmikroskopibaserad enmolekylkraftspektroskopi (AFM-SMFS). Därför ger denna studie en användbar strategi för polyprotein teknik och immobilisering.

Introduction

Jämfört med syntetiska polymerer har naturliga multidomänproteiner en enhetlig struktur med ett välkontrollerat antal och typ av underdomäner¹. Denna funktion leder vanligtvis till förbättrad biologisk funktion och stabilitet^2,3. Många metoder, såsom cysteinbaserad disulfidbindningskoppling och rekombinant DNA-teknik, har utvecklats för att bygga ett sådant polymeriserat protein med flera domäner^4,5,6,7. Emellertid resulterar den tidigare metoden alltid i en slumpmässig och okontrollerad sekvens, och den senare leder till andra problem, inklusive svårigheten för överuttryck av giftiga och stora proteiner och rening av komplext protein med kofaktor och andra känsliga enzymer.

För att möta denna utmaning utvecklar vi en enzymatisk metod som konjugerar proteinmonomer tillsammans för polymer/polyprotein på ett stegvis sätt med hjälp av en proteinligase OaAEP1 i kombination med en proteas TEV^8,9. OaAEP1 är en strikt och effektiv endopeptidas. Två proteiner kan kopplas samman kovalent som Asn-Gly-Leu-sekvens (NGL) genom två termini av OaAEP1 på mindre än 30 min om N-ändstationen är Gly-Leu-resterna(GL) och den andra som C-ändstationen är NGL-rester¹⁰. Emellertid leder användningen av OaAEP1 endast för att länka proteinmonomer till en proteinpolymer med en okontrollerad sekvens som cysteinbaserad kopplingsmetod. Därför designar vi N-ändstationen för proteinenheten med en löstagbar TEV-proteasplats plus en lucinrester som ENLYFQ/G-L-POI. Innan TEV klyvning, N-terminalen skulle inte delta i OaAEP1 ligering. Och sedan GL rester vid N-ändstation, som är förenliga med ytterligare OaAEP1 ligering, utsätts efter TEV klyvning. Således har vi uppnått en sekventiell enzymatisk biosyntesmetod av polyprotein med en relativt välkontrollerad sekvens.

Här kan vår stegvisa enzymatiska syntesmetod användas i polyproteinprovberedning, inklusive sekvensstyrd och okontrollerad, och proteinimmobilisering för enmolekylsstudier också, särskilt för det komplexa systemet som metalloprotein.

Dessutom tillåter AFM-baserade SMFS-experiment oss att bekräfta proteinpolymerkonstruktion och stabilitet på enmolekylsnivå. Enmolekylkraftspektroskopi, inklusive AFM, optisktweezer och magnetisktweezer, är ett allmänt verktyg inom nanoteknik för att manipulera biomolekylen mekaniskt och mäta deras stabilitet^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20}. AFM med en molekyl har använts i stor utsträckning vid studiet av protein (un)vikning^{21,22,23,24,25}, styrkemätning av receptor-ligand interaktion^{26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35}, oorganisk kemisk bindning^{20,36,37,38,39,40,41,42,43} och metall-ligan och bindning i metalloprotein^{44,45,46,47,48,49,50} . Här används enmolekylsAFM för att verifiera den syntetiserade polyproteinsekvensen baserat på motsvarande proteinpågående signal.

Protocol

1. Proteinproduktion Genklon Köp gener kodning för protein av intresse (POI): Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, cellulosa-bindande modul (CBM), dockerin-X domän (XDoc) och sammanhållning från Ruminococcus flavefacience, tobak etsvirus (TEV) proteas, elastin-liknande polypeptider (ELPs). Utför polymeraskedjereaktion och använd tre-begränsning matsmältningsenzym system BamHI-BglII-KpnI för att kombinera genen …

Representative Results

De NGL-rester som införs mellan angränsande proteiner genom OaAEP1 ligering påverkar inte proteinmonomerstabiliteten i polymeren som den pågående kraften (<Fu>) och konturlängdsökningen (<ΔLc>) är jämförbar med den tidigare studien(figur 1). Reningsresultatet av rubredoxinproteinet visas i figur 2. För att bevisa proteinet efter TEV klyvning är kompatibel med följande OaAEP1 ligering att konstruera proteinpolymer med en kontro…

Discussion

Vi har beskrivit ett protokoll för enzymatisk biosyntes och immobilisering av polyprotein och verifierat polyproteindesign av AFM-baserade SMFS. Denna metod ger en ny metod för att bygga protein-polymer i en utformad sekvens, som kompletterar tidigare metoder för polyprotein teknik och immobilisering^{4,6,52,53,54,55,</…}

Materials

iron (III) chloride hexahydrate	Energy chemical		99%
Zinc chloride	Alfa Aesar		100.00%
calcium chloride hydrate	Alfa Aesar		99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid	Sigma Life Science		Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane	Sigma-Aldrich		≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate	Thermo Scientific		90%
Glycerol	Macklin		99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)	Alfa Aesar
Genes	Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM	JPK Germany
MLCT cantilever	Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL	GE Healthcare
AKTA FPLC system	GE Healthcare
Glass coverslip	Sail Brand
Nanodrop 2000	Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge	Beckman Coulter
Gel Image System	Tanon