I arbetsflödet beskrivs prestanda för tids- och kostnadseffektiv berikning av flera proteinändringar efter translationella (PTM) samtidigt för kvantitativ global proteomanalys. Protokollet använder peptid-nivå PTM anrikning med flera konjugerade antikroppar, följt av dataoberoende förvärv massa pektrometri analys för att få biologiska insikter i PTM överhörning.
Studera flera post-translationella modifieringar (PTM) av proteiner är ett viktigt steg för att förstå PTM överhörning och få mer holistiska insikter i proteinfunktion. Trots vikten av multi-PTM anrikning studier, få studier undersöka mer än en PTM i taget, delvis på grund av kostnader, tid och stora proteinmängder som krävs för att utföra flera globala proteomiska analys av PTM. Den an-pot” affinitet srikulation som beskrivs i detta protokoll övervinner dessa hinder genom att tillåta samtidig identifiering och kvantifiering av peptider med lysinrester som innehåller acetylation och koncishet PTMs med låga mängder prov Input. Protokollet innebär beredning av proteinlysa från muslever av SIRT5 knockout möss, prestanda trypsin matsmältning, berikning för PTMs, och prestanda av massa spektrometrisk analys med hjälp av en dataoberoende förvärv (DIA) arbetsflöde. Eftersom det här arbetsflödet gör det möjligt att berika två PTM-produkter från samma prov samtidigt, ger det ett praktiskt verktyg för att studera PTM-överhörning utan att kräva stora mängder prover, och det minskar avsevärt den tid som krävs för provberedning, data förvärv och analys. Dia-komponenten i arbetsflödet ger omfattande PTM-specifik information. Detta är särskilt viktigt vid studier av PTM webbplats lokalisering, som DIA ger omfattande uppsättningar av fragmentjoner som kan beräknas beräkningsmässigt att skilja mellan olika PTM lokalisering isoforms.
En myriad av post-translationella ändringar reglerar dynamiskt proteiner och vägar genom effekter på aktiviteten1,signalerar2, och omsättning3,4. Till exempel aktiveras eller inaktiveras proteinkinaser genom tillsats av fosfatgrupper5, och histonacetylation och andra ändringar ger en mekanism för att ändra kromatinstrukturen och fungera som transkriptionella regleringsmekanismer6,7. Under de senaste åren har bevis monterats att flera PTM-grupper arbetar i samförstånd eller konkurrera r att reglera proteinfunktion eller aktivitet8,9,10,11. Därför är förståelse PTM överhörning ett växande behov i PTM forskning. De flesta tillgängliga proteomiska arbetsflöden för att identifiera och kvantifiera PTM-webbplatser fokuserar dock på enstaka ändringar, snarare än samspelet mellan flera ändringar. Det beskrivna arbetsflödet korrelerar specifika proteinmodifiering “hot-spots” och lysinrester som modifieras av flera olika PTM.
Det finns ett växande behov i det vetenskapliga samfundet för genomförbara metoder för att studera flera PTM samtidigt12. De flesta metoder för att globalt identifiera och kvantifiera platserna för flera typer av PTM är utmanande på grund av de höga kostnader och mängden vävnad som krävs12,13. Inte bara är multi-PTM anrikning experiment tidskrävande när det gäller provberedning, datainsamling och dataanalys, men dessa studier kräver vanligtvis stora och ofta oöverkomliga mängder protein11. Beskrivs här är ett protokoll för samtidig anrikning och analys av flera PTM, som också behandlar flera av dessa hinder och möjliggör storskalig PTM profilering och bedömning mellanhörning mellan olika PTMs14. Detta en-pot arbetsflöde beskriver ett praktiskt sätt för biomedicinska forskare att globalt profil flera PTMs, identifiera co-modifierade peptider, och studera PTM överhörning på ett effektivt och kostnadseffektivt sätt14,15.
Här visas denna metod upp genom att undersöka mitokondriell proteinaylering, som först studerades för över 50 år sedan16. Det koncentrerar sig specifikt på lysinacetylation17 och koncisering18, inklusive samförekomst av dessa ändringar på proteiner och även co-modifiering på peptidnivå. Eftersom studien använder en sirtuin 5 (SIRT5) knockout mus modell, valdes det att fokusera på anrikning av acetylation och koncisathet platser. Detta beslut fattades eftersom koncistningplatser är måltavlor för SIRT5 desuccinylase och förväntas därför visa betydande uppreglering hos KO-möss, vilket gör dem till de mest relevanta PTM i detta fall. Båda PTM är biologiskt relevanta som nyligen sammanfattas av Carrico et al.19. I allmänhet visar acetylation viktiga effekter på genuttryck och metabolism, och koncistivhet har rapporterats för att reglera hjärtmetabolism och funktion20.
Det beskrivna protokollet kan utföras med en låg mängd proteiningångsmaterial (t.ex. 1 mg proteinlysning) och minskar experimentets totala varaktighet genom att minska den tid som ägnas åt provbehandling, MS-förvärv och dataanalys. Ett arbetsflödeschema finns i figur 1. Vi har också använt ännu lägre mängder utgångsmaterial (ner till 100 μg proteinlysa, skala ner mängden pärlor som används därefter), vilket som väntat minskar den totala avkastningen av identifierade acylated peptider; Det ger dock fortfarande mycket värdefulla resultat och kvantifierbara acylated peptider.
Medan så kallade uppifrån och ned eller mitten-down arbetsflöden vanligtvis inte använder proteolytiska matsmältningmetoder (och därmed upprätthålla anslutningen av flera PTMs inom ett protein), fokuserar detta protokoll på en peptid-baserad affinity anrikning strategi för att få extra djup och känslighet för PTM identifiering och kvantifiering(figur 1). Dessutom använder detta peptid-centrerad arbetsflöde moderna masspektrometri metoder, inklusive 1) en kombination av databeroende förvärv (DDA) för att generera spektrala bibliotek, och 2) dataoberoende förvärv (DIA) för korrekt PTM kvantifiering i ett etikettfritt arbetsflöde.
DIA arbetsflöden övervinna provtagning stochasticity av typiska DDA scan system genom att omfattande fragmentera alla peptid signaler inom samplade m / z intervall21. Denna funktion är också mycket fördelaktigt när det gäller webbplats lokalisering, eftersom det är lättare att få information om vilka specifika fragmentjoner ändras inom peptid. Dessutom gör DIA-arbetsflöden identifiering och kvantifiering av mindre PTM-peptidisoformer med identiska prekursorjoner. DIA-metoder kan också bestämma en specifik PTM-platslokalisering inom en peptid baserat på specifika motsvarande fragmentjoner som mäts utförligt hela tiden. DDA-metoder använder dock ofta “dynamisk uteslutning” funktioner som utesluter flera provtagningar av MS/MS för samma prekursorjon, vilket saknar mindre PTM-isoformer.
Den samtidiga anrikningsstrategi som beskrivs här är idealisk för studier som kommer att dra nytta av den globala profilering och kvantifiering av flera PTMs, undersöka PTM-överhörning och förstå de dynamiska interaktionerna mellan ändringar efter översättning. Identifiering av flera berikade PTM-företag i ett kombinerat arbetsflöde har beskrivits av: global, seriell eller parallell anrikning av PTM som innehåller proteolytiska peptider, eller alternativt genom analys av intakta proteiner. I direkt jämförelse med seriell anrikning av acetylation och koncisation, effektiviteten i en pott metod infördes som mycket liknande14. Dessa alternativa protokoll kräver betydande mängder utgångsmaterial och tid och kan vara oöverkomligt dyra. Däremot ger en pottprotokollet en billig och effektiv metod för anrikning av mer än en PTM med efterföljande analys och identifiering.
Muslevervävnader erhålls från SIRT5-knockoutmöss och används här som startmaterial. Detta protokoll kan också utföras för proteinlysning från olika vävnader eller cellkulturexperiment. Detta protokoll kan tillämpas på proteinlysa som erhållits från vävnader eller cellkulturpellets.
Detta protokoll beskriver en ny teknik för samtidig multipel PTM anrikning för att mer effektivt förstå PTM crosstalk. Alternativa metoder för att nå detta mål tenderar att vara oöverkomligt tidskrävande och dyrt, och de kräver stora mängder protein för att lyckas11,13. Detta protokoll presenterar ett arbetsflöde för anrikning med flera ptm-medel som innebär inkubation i antikroppskonjuperade pärlor för två PTM-tillverkare samtidigt för att förbättra experimentets övergripande effektivitet. Denna metod innebär också användning av DDA för spektralbibliotek generation och DIA MS förvärv för att upptäcka och kvantifiera peptider som finns med minskad inblandning från fragmentjoner22,23. Program, såsom MS databas sökmotorer används för att analysera och kvantifiera data från DDA förvärv, medan kvantitativa proteomics Software24 och specifika DIA kvantitativanalys Software25 är nödvändiga för att tolka den komplexa spektra produceras av DIA förvärv.
Det finns flera kritiska steg i detta protokoll som bör följas noggrant. Eftersom det huvudsakliga målet med protokollet är att berika för flera PTM samtidigt är antikroppsaffinitetsanrikningssteget (avsnitt 2) avgörande för experimentets framgång. När du utför tvättar på pärlorna, är det nödvändigt att se till att ingen av pärlorna är sugs oavsiktligt. Att säkerställa att ureakoncentrationen har spädts ut till 1 M före matsmältningen med trypsin (steg 1.8) är också nödvändigt. Även om 8 M urea krävs tidigare i protokollet för proteinlöslighet, kommer urea koncentrationer över 1 M hämma trypsin s enzymatisk aktivitet. Dessutom är det viktigt att konsekvent kontrollera provets pH-kort i hela protokollet. Detta är särskilt viktigt före matsmältningen. Om pH för provet och trypsin-lösningen inte neutraliseras på lämpligt sätt före inkubationsinkubationen, kan det resultera i en ineffektiv matsmältning där många klyvningsplatser kan missas, vilket resulterar i färre peptididentifieringar.
Några ändringar i protokollet kan vara till hjälp när du förbereder prover. För ett protein som upphandlas från 1 mg utgångsmaterial kan en fjärdedel av antikroppspärlorna som tillhandahålls i varje PTM-skanningsrör användas som ett kostnadseffektivt alternativ. En större mängd utgångsmaterial kan användas för bättre resultat, så länge mängden antikroppar pärlor som används ökar proportionellt. En annan ändring som kan förbättra arbetsflödet är att smälta prover med en annan proteas förutom trypsin. Denna ändring skulle resultera i mer variation i peptider kaverade, vilket ger ökad täckning av proteinrester. Även om det inte är nödvändigt, rekommenderas att trypsin vara en av de enzymer som används för PTM analys på grund av dess höga klyvning specificitet26.
En begränsning av detta protokoll är att de PTMs som studeras måste ha liknande kemister för att berikas samtidigt14. Förfarandena för de olika antikroppskonjuperade pärlorna måste vara likartade, med hjälp av liknande lösningsmedel och lösningar, inklusive liknande elutionvillkor, och helst från samma leverantör. Av denna anledning använder den metod som beskrivs här konsekvent acetylation och koncishet som ett exempel, som båda använder antikroppskonjuperade pärlor (Cell Signaling Technology, Inc). Även om denna metod teoretiskt kan tillämpas på valfritt antal ptm-avgifter, skulle ytterligare studier behövas för att bedöma den exakta begränsningen av protokollet i detta avseende. Eftersom detta är en antikroppsbaserad berikningsmetod kan metoden dessutom endast ge en relativ kvantifiering av PTM-anläggningar.
I jämförelse med befintliga multi-PTM anrikningmetoder är det här arbetsflödet ett mer genomförbart och kostnadseffektivt alternativ. Från detta experiment observerades att effekten av denna metod jämför mycket väl med alternativa metoder, såsom individuella eller seriella anrikningar. Figur 2B visar att median-CV för modifierade peptid toppområden faktiskt minskade i en-pot-metoden jämfört med en-PTM anrikning och seriell-PTM anrikning13. Vi analyserade vidare de experimentella resultaten som bedömde kvantifieringar på platsnivå för acetylation eller koncisation. Dessutom visade Spearman korrelationsanalys(figur 2C,D)att en pott PTM-anrikningen utfördes på samma sätt som arbetsflödena för en PTM-anrikning. Detta gällde även för konkorrelationer på peptid- och fragmentnivå. Samma observation som hölls för alla tre korrelationer när man jämför en pott med seriell-PTM anrikning.
Detta protokoll gör det möjligt för forskare att göra fascinerande biologiska insikter i PTM-överhörning på ett snabbt och kostnadseffektivt sätt. DIA-komponenten i arbetsflödet gör det möjligt för forskare att förstå mer om PTM, eftersom det ger information om lokalisering av webbplatser och övervinner utmaningar som låg platsbeläggning av PTMs. Prekursorjoner tenderar att uteslutas med DDA, vilket är särskilt viktigt när man studerar PTM, eftersom platsbeläggningen ofta är låg till den punkt där dessa peptider inte blir utvalda för MS/MS men fortfarande innehåller viktig information. Uppföljningsexperiment kan utföras för att bedöma den övre gränsen för hur många PTM-skivor som kan berikas samtidigt med den här metoden. En framtida förbättring av detta arbetsflöde kan omfatta utveckling av mer avancerade mjukvaruplattformar för att ytterligare automatisera analysen av lokalisering av webbplats och BELÄGGNING AV PTM-webbplatser.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner stödet från NIH delade instrumenteringsbidrag för TripleTOF-systemet vid Buck Institute (1S10 OD016281). Detta arbete stöddes också av National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 till B.S.) och National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 till Eric Verdin; R01 DK090242 till Eric Goetzman). X.X. stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (NIH bevilja T32GM8806, till Judith Campisi och Lisa Ellerby), NB stöddes av en postdoktoral gemenskap från Glenn Foundation for Medical Research.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |