Denne arbejdsgang beskriver ydeevnen af tids- og omkostningseffektiv berigelse af flere proteinændringer efter oversættelser (PTM)samtidig til kvantitativ global proteomisk analyse. Protokollen udnytter peptid-niveau PTM berigelse med flere konjugerede antistoffer, efterfulgt af data-uafhængige erhvervelse massespektrometri analyse for at få biologisk indsigt i PTM krydstale.
Undersøgelse af flere post-translationelle ændringer (PTMs) af proteiner er et afgørende skridt til at forstå PTM krydstale og få mere holistisk indsigt i protein funktion. På trods af betydningen af multi-PTM berigelse undersøgelser, få undersøgelser undersøge mere end én PTM ad gangen, dels på grund af udgifter, tid og store proteinmængder, der kræves for at udføre flere globale proteomiske analyse af PTM’ er. Den “one-pot” affinitetberigelse, der er beskrevet i denne protokol, overvinder disse hindringer ved at tillade samtidig identifikation og kvantificering af peptider med lysinrester indeholdende eddikeog korttidsopblandingPT’er med lave mængder prøve Input. Protokollen indebærer forberedelse af protein lysat fra muselever af SIRT5 knockout mus, udførelse af trypsin fordøjelse, berigelse for PTMs, og udførelse n af massespektrometrisk analyse ved hjælp af en data-uafhængig erhvervelse (DIA) workflow. Da denne arbejdsgang gør det muligt at tilsaøse to PTMs fra samme prøve samtidig, giver den et praktisk redskab til at studere PTM krydstale uden at kræve store mængder prøver, og det reducerer i høj grad den tid, der kræves til prøveforberedelse, data erhvervelse og analyse. DIA-komponenten i arbejdsprocessen indeholder omfattende PTM-specifikke oplysninger. Dette er især vigtigt, når man studerer PTM site lokalisering, som DIA giver omfattende sæt af fragment ioner, der kan beregningsmæssigt dechifreres at skelne mellem forskellige PTM lokalisering isoformer.
Et utal af post-translationelle ændringer dynamisk regulere proteiner og veje gennem virkninger på aktiviteten1, signalering2, og omsætning3,4. F.eks. aktiveres eller deaktiveres proteinkinaser ved tilsætning af fosfatgrupper5, og histoneacetylation og andre ændringer giver en mekanisme til at ændre kromatinstrukturen og fungere som transskriptionelle reguleringsmekanismer6,7. I de senere år har der været dokumentation for , at flere PTM’er arbejder i fællesskab eller konkurrerer om at regulere proteinfunktion eller aktivitet8,9,10,11. Derfor forståelse PTM krydstale er et nyt behov i PTM forskning. De fleste tilgængelige proteomiske arbejdsgange til at identificere og kvantificere PTM-websteder fokuserer dog på enkelte ændringer i stedet for samspillet mellem flere ændringer. Den beskrevne arbejdsgang korrelerer specifikke proteinmodifikation “hot-spots” og lysinrester, der er modificeret af flere forskellige PTMs.
Der er et stigende behov i det videnskabelige samfund for gennemførlige metoder til at studere flere PTMs samtidig12. De fleste metoder til globalt at identificere og kvantificere lokaliteterne for flere typer PTM ‘er udfordrende på grund af de høje omkostninger og mængden af væv , der kræves12,13. Ikke alene er multi-PTM berigelse eksperimenter tidskrævende med hensyn til prøve forberedelse, dataindsamling, og dataanalyse, men disse undersøgelser kræver typisk store og ofte uoverkommelige mængder af protein11. Beskrevet her er en protokol for samtidig berigelse og analyse af flere PTMs, som også omhandler flere af disse barrierer og muliggør storstilet PTM profilering og vurdering krydstale mellem forskellige PTMs14. Denne one-pot workflow skitserer en praktisk måde for biomedicinske forskere til globalt profil flere PTMs, identificere co-modificerede peptider, og studere PTM krydstale i en effektiv og omkostningseffektiv måde14,15.
Her er denne metode fremvist ved at undersøge mitokondriel protein acylation, som først blev undersøgt over 50 år siden16. Det koncentrerer sig specifikt om lysin acetylation17 og kortfattetlation18, herunder co-forekomst af disse ændringer på proteiner og endda co-modifikation på peptid niveau. Da undersøgelsen bruger en sirtuin 5 (SIRT5) knockout mus model, blev det valgt at fokusere på berigelse af acetylation og kortfattetlation steder. Denne beslutning blev truffet, fordi korthedslokaliteter er mål for SIRT5 desuccinylase og derfor forventes at udvise betydelig opregulering i KO-mus, hvilket gør dem til de mest relevante PTM’er i dette tilfælde. Begge PTM’er er biologisk relevante som for nylig opsummeret af Carrico et al.19. Generelt, acetylation viser vigtige virkninger på genekspression og stofskifte, og kortfattetlation er blevet rapporteret til at regulere hjertemetabolisme og funktion20.
Den beskrevne protokol kan udføres med en lav mængde proteininputmateriale (f.eks. 1 mg proteinlysat) og reducerer forsøgets samlede varighed ved at reducere den tid, der bruges til prøvebehandling, MS-erhvervelse og dataanalyse. Der findes en arbejdsgangsskemai figur 1. Vi har også brugt endnu lavere mængder udgangsmateriale (ned til 100 μg protein lysat, skalering ned de mængder af perler, der anvendes i overensstemmelse hermed), hvilket som forventet reducerer det samlede udbytte af identificerede acylated peptider; men, Det giver stadig meget værdifulde resultater og kvantificerbare acylated peptider.
Mens såkaldte top-down eller midt-down arbejdsgange typisk ikke bruger proteolytiske fordøjelse tilgange (og dermed opretholde tilslutning af flere PTMs inden for et protein), denne protokol fokuserer på en peptid-baseret affinitet berigelse tilgang til at få ekstra dybde og følsomhed for PTM identifikation og kvantificering (Figur 1). Desuden anvender denne peptid-centreret arbejdsgang moderne massespektrometrimetoder, herunder 1) en kombination af dataafhængig erhvervelse (DDA) til at generere spektralbiblioteker og 2) datauafhængige anskaffelse (DIA) til nøjagtig PTM-kvantificering i en etiketfri arbejdsgang.
DIA-arbejdsgange overvinder prøveudtagning af typiske DDA-scanningsordninger ved at fragmentere alle peptidsignaler inden for det samplede m/z-område21. Denne funktion er også yderst gavnligt med hensyn til lokalisering af webstedet, fordi det er lettere at få oplysninger om, hvilke specifikke fragmentioner der ændres i peptidet. Desuden tillader DIA-arbejdsgange identifikation og kvantificering af mindre PTM-peptidisoformer med identiske forløberioner. DIA metoder kan også bestemme en bestemt PTM site lokalisering i et peptid baseret på specifikke tilsvarende fragment ioner, der er omfattende målt på alle tidspunkter. DDA-tilgange anvender dog ofte “dynamiske udelukkelsesfunktioner”, der udelukker flere prøveudtagninger af MS/MS for den samme forløber, og mangler dermed mindre PTM-isoformer.
Den samtidige berigelsesstrategi, der er beskrevet her, er ideel til undersøgelser, der vil drage fordel af den globale profilering og kvantificering af flere PTM’er, undersøge PTM-krydstale og forstå de dynamiske interaktioner mellem posttranslationelle ændringer. Identifikation af flere berigede PTM’er i én kombineret arbejdsgang er beskrevet ved: global, seriel eller parallel berigelse af PTM indeholdende proteolytiske peptider eller alternativt ved analyse af intakte proteiner. I direkte sammenligning med seriel berigelse af acetylation og korthedsopning blev effektiviteten af one-pot-metoden fastslået som meget ens14. Disse alternative protokoller kræver betydelige mængder af udgangsmateriale og tid og kan være uoverkommeligt dyre. I modsætning hertil giver one-pot-protokollen en billig og effektiv metode til berigelse af mere end én PTM med efterfølgende analyse og identifikation.
Mus levervæv er fremstillet af SIRT5 knockout mus og bruges her som udgangsmateriale. Denne protokol kan også udføres for protein lysater fra forskellige væv eller cellekultur eksperimenter. Denne protokol kan anvendes på proteinlysater fremstillet af væv eller cellekulturpiller.
Denne protokol beskriver en ny teknik til samtidig flere PTM berigelse til mere effektivt at forstå PTM krydstale. Alternative metoder til at nå dette mål har tendens til at være uoverkommeligt tidskrævende og dyre, og de kræver , at store mængder protein lykkes11,13. Denne protokol præsenterer en multi-PTM berigelse workflow, der indebærer inkubation i antistof-konjugerede perler til to PTMs på én gang for at forbedre den samlede effektivitet af forsøget. Denne metode indebærer også anvendelse af DDA til spektral biblioteksgenerering og DIA MS-opkøb til at opdage og kvantificere de tilstedeværende peptider med reduceret interferens fra fragmentioner22,23. Softwareprogrammer, såsom MS database søgemaskiner bruges til at analysere og kvantificere data fra DDA opkøb, mens kvantitative Proteomics Software24 og specifikke DIA kvantitative analyse Software25 er nødvendige for at fortolke de komplekse spektre produceret af DIA opkøb.
Der er flere kritiske trin i denne protokol, som bør følges nøje. Da hovedformålet med protokollen er at berige for flere PTMs samtidigt, antistof-affinitet berigelse trin (afsnit 2) er afgørende for succes eksperimentet. Når du udfører vasker på perlerne, er det nødvendigt at sikre, at ingen af perlerne er indsugning ved et uheld. Det er også nødvendigt at sikre, at urinstofkoncentrationen er fortyndet til 1 M før fordøjelsen med trypsin (trin 1.8). Selv om 8 M urea er påkrævet tidligere i protokollen for protein opløselighed, urea koncentrationer over 1 M vil hæmme trypsin’s enzymatiske aktivitet. Desuden er det vigtigt konsekvent at kontrollere prøvens pH-pc i hele protokollen. Dette er især vigtigt før fordøjelsen. Hvis prøvens pH-pH og trypsinopløsningen ikke neutraliseres korrekt før inkubationen, kan det resultere i en ineffektiv fordøjelse, hvor mange spaltningssteder kan gå glip af, hvilket resulterer i færre peptididentifikationer.
Et par ændringer af protokollen kan være nyttige, når du forbereder prøver. For et protein lysate indkøbt fra 1 mg udgangsmateriale, en fjerdedel af antistof perler ne i hvert PTM scanningsrør kan bruges som et omkostningseffektivt alternativ. En større mængde udgangsmateriale kan bruges til bedre resultater, så længe mængden af anvendte antistofperler øges forholdsmæssigt. En anden ændring, der kan forbedre arbejdsgangen er at fordøje prøver med en anden protease ud over trypsin. Denne ændring ville resultere i større variation i peptider kløvet, hvilket giver øget dækning af proteinrester. Selvom det ikke er nødvendigt, anbefales det, at trypsin være et af de enzymer, der anvendes til PTM analyse på grund af sin høje kavalergang specificitet26.
En begrænsning af denne protokol er, at de ptms, der undersøges , skal have lignende kemifor at blive beriget samtidig14. Procedurerne for de forskellige antistofkonjugerede perler skal være ens, idet lignende opløsningsmidler og opløsninger, herunder lignende elueringsbetingelser, og helst fra samme leverandør. Af denne grund, den metode, der er skitseret her konsekvent bruger acetylation og kortfattetlation som et eksempel, som begge bruger antistof-konjugerede perler (Cell Signaling Technology, Inc). Selv om denne metode teoretisk set kan anvendes på et vilkårligt antal PTM’er, vil der være behov for yderligere undersøgelser for at vurdere protokollens nøjagtige begrænsning i denne henseende. Da dette er en antistofbaseret berigelsesmetode, kan metoden desuden kun give en relativ kvantificering af PTM-steder.
Sammenlignet med eksisterende multi-PTM berigelse metoder, denne arbejdsgang er et mere realistisk og omkostningseffektivt alternativ. Ud fra dette eksperiment blev det bemærket, at effekten af denne metode er meget godt sammenlignet med alternative metoder, såsom individuelle eller serielle berigelser. Figur 2B viser , at median-CV’et for modificerede peptidpeakområder faktisk blev nedsat i onepotmetoden sammenlignet med enkelt-PTM-berigelser og seriePTM-berigelser13. Vi analyserede yderligere de eksperimentelle resultater, der vurderede kvantificeringer på site-niveau for acetylation eller korthedsopning. Desuden viste Spearman-korrelationsanalysen (figur 2C,D),at enpotptionsberigelsen udførte på samme måde som arbejdsgangene for enkelt-PTM-berigelse. Dette var også tilfældet for peptid- og fragment-niveau korrelationer. Den samme observation for alle tre korrelationer, når man sammenligner en pot med seriel PTM berigelse.
Denne protokol giver forskerne mulighed for at gøre fascinerende biologisk indsigt i PTM krydstale på en hurtig og omkostningseffektiv måde. DIA-komponenten i arbejdsgangen giver forskerne mulighed for at forstå mere om PTMs, da det giver oplysninger om lokalisering af webstedet og overvinder udfordringer såsom lav belægning af PTM’er. Prækursorer har tendens til at blive udelukket med DDA, hvilket er særlig vigtigt, når man studerer PTMs, da belægningen på stedet ofte er lav til det punkt, hvor disse peptider ikke bliver udvalgt til MS/MS, men stadig indeholder vigtige oplysninger. Der kan udføres opfølgende forsøg for at vurdere den øvre grænse for, hvor mange PTM’er der kan beriges samtidigved hjælp af denne metode. En fremtidig forbedring af denne arbejdsgang kan omfatte udvikling af mere avancerede softwareplatforme for yderligere at automatisere analysen af lokalisering af webstedet og PTM-webstedsbelægning.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender støtten fra NIH’s delte instrumenteringslegat til TripleTOF-systemet på Buck Institute (1S10 OD016281). Dette arbejde blev også støttet af National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 til B.S.) og National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 to Eric Verdin; R01 DK090242 til Eric Goetzman). X.X. blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health (NIH grant T32GM8806, til Judith Campisi og Lisa Ellerby), NB blev støttet af en postdoc stipendium fra Glenn Foundation for Medical Research.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |