यह कार्यप्रवाह मात्रात्मक वैश्विक प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए एक साथ कई प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएमएस) के समय और लागत कुशल संवर्धन के प्रदर्शन का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल कई संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ पेप्टाइड-स्तरीय पीटीएम संवर्धन का उपयोग करता है, जिसके बाद पीटीएम क्रॉसटॉक में जैविक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण किया जाता है।
प्रोटीन के कई पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) का अध्ययन पीटीएम क्रॉसटॉक को समझने और प्रोटीन फ़ंक्शन में अधिक समग्र अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। मल्टी-पीटीएम संवर्धन अध्ययनों के महत्व के बावजूद, कुछ अध्ययन एक समय में एक से अधिक पीटीएम की जांच करते हैं, आंशिक रूप से पीटीएमएस के कई वैश्विक प्रोटेओमिक विश्लेषण करने के लिए आवश्यक खर्चों, समय और बड़ी प्रोटीन मात्रा के कारण। इस प्रोटोकॉल में विस्तृत “वन-पॉट” आत्मीयता संवर्धन इन बाधाओं को एक साथ पहचान और लाइसिन अवशेषों के साथ पेप्टाइड की मात्रा की अनुमति देकर इन बाधाओं को दूर करता है जिसमें कम मात्रा में एसिटिलेशन और संक्षिप्त ताम्म युक्त नमूना इनपुट. प्रोटोकॉल में SIRT5 नॉकआउट चूहों के माउस यकृत से प्रोटीन लाइसेट की तैयारी, ट्राइप्सिन पाचन का प्रदर्शन, पीटीएमएस के लिए संवर्धन, और डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण (व्यास) कार्यप्रवाह का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण का प्रदर्शन शामिल है। क्योंकि यह कार्यप्रवाह एक साथ एक ही नमूने से दो पीटीएम के संवर्धन के लिए अनुमति देता है, यह बड़ी मात्रा में नमूनों की आवश्यकता के बिना पीटीएम क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए एक व्यावहारिक उपकरण प्रदान करता है, और यह नमूना तैयारकरने, डेटा के लिए आवश्यक समय को बहुत कम कर देता है अधिग्रहण, और विश्लेषण। कार्यप्रवाह का व्यास घटक व्यापक पीटीएम-विशिष्ट जानकारी प्रदान करता है। पीटीएम साइट स्थानीयकरण का अध्ययन करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि डीआईए टुकड़ों आयनों के व्यापक सेट प्रदान करता है जिन्हें विभिन्न पीटीएम स्थानीयकरण आइसोफॉर्म के बीच अंतर करने के लिए गणना रूप से समझा जा सकता है।
ट्रांसलेशनल संशोधनों के असंख्य गतिशील रूप से1गतिविधि 1, सिग्नलिंग2और टर्नओवर3,4पर प्रभाव के माध्यम से प्रोटीन और रास्तों को विनियमित करते हैं । उदाहरण के लिए, फॉस्फेटसमूह5के अलावा प्रोटीन किनेस को सक्रिय या निष्क्रिय कर दिया जाता है, और हिस्टोन एसिटिलेशन और अन्य संशोधन क्रोमेटिन संरचना को बदलने और प्रतिलेखन नियामक तंत्र6,7के रूप में काम करने के लिए एक तंत्र प्रदान करते हैं। हाल के वर्षों में, सबूत ों ने इस बात का सबूत दिया है कि कई पीटीएमएस कॉन्सर्ट में काम करते हैं या प्रोटीन फंक्शन या गतिविधि8,9,10,11को विनियमित करने के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं । इसलिए पीटीएम क्रॉसटॉक को समझना पीटीएम रिसर्च की उभरती जरूरत है। हालांकि, पीटीएम साइटों की पहचान करने और निर्धारित करने के लिए अधिकांश उपलब्ध प्रोटेओमिक वर्कफ्लो कई संशोधनों के परस्पर क्रिया के बजाय एकल संशोधनों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। वर्णित कार्यप्रवाह विशिष्ट प्रोटीन संशोधन “हॉट-स्पॉट” और लाइसिन अवशेषों से संबंधित है जिन्हें कई अलग-अलग पीटीएमएस द्वारा संशोधित किया जाता है।
वैज्ञानिक समुदाय में एक साथ12पीटीएम का अध्ययन करने के लिए व्यवहार्य तरीकों की आवश्यकता बढ़ रही है . कई प्रकार के पीटीएमएस की साइटों की विश्व स्तर पर पहचान और मात्रा निर्धारित करने के अधिकांश तरीके चुनौतीपूर्ण हैं क्योंकि उच्च लागत और ऊतककी मात्रा12,13की आवश्यकता होती है . न केवल नमूना तैयारी, डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण के मामले में बहु-पीटीएम संवर्धन प्रयोग समय लेने वाले हैं, बल्कि इन अध्ययनों में आमतौर पर प्रोटीन11की बड़ी और अक्सर निषेधात्मक मात्रा की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित कई पीटीएमएस के एक साथ संवर्धन और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल है, जो इनमें से कई बाधाओं को भी संबोधित करता है और विभिन्न पीटीएमएस14के बीच क्रॉसटॉक का आकलन करने और बड़े पैमाने पर पीटीएम प्रोफाइलिंग और आकलन करने में सक्षम बनाता है। यह एक बर्तन कार्यप्रवाह जैव चिकित्सा शोधकर्ताओं के लिए विश्व स्तर पर कई PTMs प्रोफ़ाइल, सह संशोधित पेप्टाइड्स की पहचान करने और एक कुशल और लागत प्रभावी तरीके से पीटीएम क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका रेखांकित करता है14,15।
यहां, इस विधि को माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन एसिलेशन की जांच करके प्रदर्शित किया जाता है, जिसका पहली बार16साल पहले 50 साल से अधिक अध्ययन किया गया था। यह विशेष रूप से लाइसिन एसीटिलेशन17 और संक्षिप्त18पर केंद्रित है, जिसमें प्रोटीन पर इन संशोधनों की सह-घटना और पेप्टाइड स्तर पर सह-संशोधन भी शामिल है। चूंकि अध्ययन एक सिरटुइन 5 (SIRT5) नॉकआउट माउस मॉडल का उपयोग करता है, यह एसीटिलेशन और संक्षिप्तीकरण साइटों के संवर्धन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चुना गया था । यह निर्णय इसलिए किया गया था क्योंकि संक्षिप्त ीकरण साइटें SIRT5 desuccinylase के लक्ष्य हैं और इस प्रकार KO चूहों में महत्वपूर्ण अपरेगुलेशन दिखाने की उम्मीद है, जिससे उन्हें इस मामले में सबसे प्रासंगिक पीटीएमएस बना दिया गया है। दोनों PTMs जैविक रूप से प्रासंगिक के रूप में हाल ही में Carrico एट अल19द्वारा संक्षेप में कर रहे हैं । सामान्य तौर पर, एसीटिलेशन जीन अभिव्यक्ति और चयापचय पर महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाता है, और दिल के चयापचय और समारोह20को विनियमित करने के लिए संक्षिप्तता की सूचना दी गई है।
वर्णित प्रोटोकॉल प्रोटीन इनपुट सामग्री (जैसे, 1 मिलीग्राम प्रोटीन लाइसेट) की कम मात्रा के साथ किया जा सकता है और नमूना प्रसंस्करण, एमएस अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण के लिए बिताए गए समय को कम करके प्रयोग की कुल अवधि को कम करता है। चित्रा 1में एक कार्यप्रवाह योजनाबद्ध प्रदान किया जाता है। हमने शुरुआती सामग्री की भी कम मात्रा का उपयोग किया है (प्रोटीन लाइसेट के 100 μg तक नीचे, तदनुसार उपयोग किए जाने वाले मोतियों की मात्रा को स्केल करना), जो उम्मीद के अनुसार, पहचाने गए एसिलेटेड पेप्टाइड्स की समग्र उपज को कम करता है; हालांकि, यह अभी भी अत्यधिक मूल्यवान परिणाम और मात्रात्मक एसायटेड पेप्टाइड्स प्रदान करता है।
जबकि तथाकथित टॉप-डाउन या मिडिल-डाउन वर्कफ्लो आमतौर पर प्रोटेलिटिक पाचन दृष्टिकोणों का उपयोग नहीं करते हैं (और इस प्रकार एक प्रोटीन के भीतर कई पीटीएमएस की कनेक्टिविटी बनाए रखते हैं), यह प्रोटोकॉल पीटीएम पहचान और मात्राकरण(चित्रा 1)के लिए अतिरिक्त गहराई और संवेदनशीलता हासिल करने के लिए पेप्टाइड-आधारित आत्मीयता संवर्धन दृष्टिकोण पर केंद्रित है। इसके अलावा, यह पेप्टाइड-केंद्रित कार्यप्रवाह आधुनिक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विधियों का उपयोग करता है, जिसमें 1) डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) का संयोजन स्पेक्ट्रल पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए, और लेबल-मुक्त कार्यप्रवाह में सटीक पीटीएम क्वांटिफिकेशन के लिए 2) डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण (डीआईए) शामिल है।
डीआईए वर्कफ्लो ने नमूना मे/जेड रेंज21के भीतर सभी पेप्टाइड संकेतों को व्यापक रूप से खंडित करके ठेठ डीडीए स्कैन योजनाओं की नमूनाकरण पर काबू पा लिया । साइट स्थानीयकरण के मामले में यह सुविधा भी बेहद फायदेमंद है, क्योंकि पेप्टाइड के भीतर किस विशिष्ट टुकड़े आयनों को संशोधित किया जाता है, इसके बारे में जानकारी हासिल करना आसान है। इसके अलावा, डीआईए वर्कफ्लो समान अग्रदूत आयनों के साथ मामूली पीटीएम-पेप्टाइड आइसोफॉर्म की पहचान और मात्रा की अनुमति देता है। डीआईए विधियां विशिष्ट संबंधित टुकड़ों आयनों के आधार पर पेप्टाइड के भीतर एक विशिष्ट पीटीएम साइट स्थानीयकरण भी निर्धारित कर सकती हैं जिन्हें हर समय व्यापक रूप से मापा जाता है। हालांकि, डीडीए अक्सर “गतिशील बहिष्कार” सुविधाओं का उपयोग करता है जो एक ही अग्रदूत आयन के लिए एमएस/एमएस के कई नमूने को बाहर करते हैं, इस प्रकार मामूली पीटीएम आइसोफॉर्म गायब हो जाते हैं।
यहां वर्णित एक साथ संवर्धन रणनीति आदर्श रूप से अध्ययनों के लिए अनुकूल है जो कई पीटीएम की वैश्विक प्रोफाइलिंग और मात्राकरण से लाभान्वित होगी, पीटीएम क्रॉसटॉक की जांच करेगी, और ट्रांसलेशनल संशोधनों के बाद की गतिशील बातचीत को समझेगी। एक संयुक्त कार्यप्रवाह में कई समृद्ध पीटीएमएस की पहचान का वर्णन किया गया है: वैश्विक, धारावाहिक या पीटीएम के समानांतर संवर्धन जिसमें प्रोटेओलिटिक पेप्टाइड्स होते हैं, या वैकल्पिक रूप से बरकरार प्रोटीन के विश्लेषण से। एसीटिलेशन और संक्षिप्तीकरण के धारावाहिक संवर्धन के साथ सीधी तुलना में, एक बर्तन पद्धति की दक्षता बहुत समान14होने के रूप में स्थापित किया गया था । इन वैकल्पिक प्रोटोकॉल सामग्री और समय शुरू करने की महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता है और निषेधात्मक महंगा हो सकता है । इसके विपरीत, एक बर्तन प्रोटोकॉल बाद के विश्लेषण और पहचान के साथ एक से अधिक पीटीएम के संवर्धन के लिए एक सस्ती और कुशल विधि प्रदान करता है ।
माउस जिगर के ऊतकों SIRT5 नॉकआउट चूहों से प्राप्त कर रहे है और यहां शुरू सामग्री के रूप में उपयोग किया जाता है । यह प्रोटोकॉल विभिन्न ऊतकों या सेल संस्कृति प्रयोगों से प्रोटीन लाइसेट्स के लिए भी किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल ऊतकों या कोशिका संस्कृति छर्रों से प्राप्त प्रोटीन लाइकेट्स पर लागू किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल पीटीएम क्रॉसटॉक को अधिक प्रभावी ढंग से समझने के लिए एक साथ कई पीटीएम संवर्धन के लिए एक उपन्यास तकनीक का वर्णन करता है। इस उद्देश्य तक पहुंचने के वैकल्पिक तरीके निषेधात्मक रूप से समय लेने वाले और महंगे होते हैं, और उन्हें11,13को सफल होने के लिए बड़ी मात्रा में प्रोटीन की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल एक बहु-पीटीएम संवर्धन कार्यप्रवाह प्रस्तुत करता है जिसमें प्रयोग की समग्र दक्षता में सुधार करने के लिए एक बार में दो पीटीएम के लिए एंटीबॉडी-कंजुगेड मोतियों में ऊष्मायन शामिल है। इस विधि में स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी उत्पादन और डीआईए एमएस अधिग्रहण के लिए डीडीए का उपयोग भी शामिल है ताकि22,23के खंड आयनों से कम हस्तक्षेप के साथ मौजूद पेप्टाइड्स का पता लगाया जा सके और इसकी मात्रा निर्धारित की जा सके । सॉफ्टवेयर प्रोग्राम, जैसे एमएस डेटाबेस सर्च इंजन का उपयोग डीडीए अधिग्रहण से डेटा का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है, जबकि मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर24 और विशिष्ट व्यास मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर25 डीआईए अधिग्रहण द्वारा उत्पादित जटिल स्पेक्ट्रा की व्याख्या करने के लिए आवश्यक हैं।
इस प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिनका सावधानीपूर्वक पालन किया जाना चाहिए। चूंकि प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य एक साथ कई पीटीएमएस के लिए समृद्ध करना है, इसलिए प्रयोग की सफलता के लिए एंटीबॉडी-एफ़िनिटी संवर्धन कदम (धारा 2) महत्वपूर्ण है। मोतियों पर वॉश करते समय, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि कोई भी मोतियों को गलती से नहीं किया जाता है। यूरिया एकाग्रता सुनिश्चित करना ट्राइप्सिन (चरण 1.8) के साथ पाचन से पहले 1 मीटर तक पतला किया गया है। हालांकि प्रोटीन घुलनशीलता के लिए प्रोटोकॉल में पहले 8 एम यूरिया की आवश्यकता होती है, 1 एम से ऊपर यूरिया सांद्रता ट्राइप्सिन की एंजाइमैटिक गतिविधि को बाधित करेगी। इसके अलावा, पूरे प्रोटोकॉल में नमूने के पीएच की लगातार जांच करना महत्वपूर्ण है। यह पाचन से पहले विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। यदि नमूने का पीएच और ट्रिप्सिन समाधान को ऊष्मायन से पहले उचित रूप से निष्क्रिय नहीं किया जाता है, तो इसके परिणामस्वरूप एक अक्षम पाचन हो सकता है जिसमें कई दरार साइटों को याद किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कम पेप्टाइड पहचान होती है।
नमूने तैयार करते समय प्रोटोकॉल में कुछ संशोधन सहायक हो सकते हैं। 1 मिलीग्राम शुरू करने वाली सामग्री से खरीदे गए प्रोटीन लाइसेट के लिए, प्रत्येक पीटीएम स्कैन ट्यूब में प्रदान किए गए एंटीबॉडी मोतियों का एक चौथाई लागत प्रभावी विकल्प के रूप में उपयोग किया जा सकता है। शुरुआती सामग्री की एक बड़ी मात्रा का उपयोग बेहतर परिणामों के लिए किया जा सकता है, जब तक कि उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी मोतियों की मात्रा आनुपातिक रूप से बढ़ जाती है। एक और संशोधन जो कार्यप्रवाह को बढ़ा सकता है, ट्राइप्सिन के अलावा एक और प्रोटीज़ के साथ नमूनों को पचाने के लिए है। इस संशोधन के परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स क्लीव्ड में अधिक परिवर्तनशीलता आएगी, जिससे प्रोटीन अवशेषों का कवरेज बढ़ जाएगा । हालांकि आवश्यक नहीं है, यह सिफारिश की जाती है कि ट्राइप्सिन अपनी उच्च दरार विशिष्टता26के कारण पीटीएम विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों में से एक हो।
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि अध्ययन किए जा रहे पीटीएमएस को14के साथ समृद्ध होने के लिए समान रसायन ों की आवश्यकता होती है । विभिन्न एंटीबॉडी-संयुग्मित मोतियों के लिए प्रक्रियाएं समान होनी चाहिए, इसी तरह के सॉल्वैंट्स और समाधानों का उपयोग करना, जिसमें समान एल्यूशन स्थितियां शामिल हैं, और अधिमानतः एक ही विक्रेता से। इस कारण से, यहां उल्लिखित विधि लगातार एक उदाहरण के रूप में एसीटिलेशन और संक्षिप्त ताक़त का उपयोग करती है, जिनमें से दोनों एंटीबॉडी-कंजुगेड मोतियों (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, इंक) का उपयोग करते हैं। हालांकि इस विधि सैद्धांतिक रूप से पीटीएमएस के किसी भी संख्या के लिए लागू किया जा सकता है, अतिरिक्त अध्ययन के लिए इस संबंध में प्रोटोकॉल की सही सीमा का आकलन करने की जरूरत होगी । इसके अलावा, चूंकि यह एक एंटीबॉडी-आधारित संवर्धन विधि है, इसलिए विधि केवल पीटीएम साइटों का सापेक्ष मात्रा प्रदान कर सकती है।
मौजूदा मल्टी-पीटीएम संवर्धन विधियों की तुलना में, यह कार्यप्रवाह एक अधिक व्यवहार्य और लागत प्रभावी विकल्प है। इस प्रयोग से, यह देखा गया कि इस विधि की प्रभावकारिता व्यक्तिगत या धारावाहिक संवर्धन जैसे वैकल्पिक तरीकों के साथ बहुत अच्छी तरह से तुलना करती है। चित्रा 2बी से पता चलता है कि संशोधित पेप्टाइड पीक क्षेत्रों के लिए औसत सीवी वास्तव में एकल-पीटीएम संवर्धन और धारावाहिक-पीटीएम संवर्धन13की तुलना में एक बर्तन विधि में कम हो गया था । हमने एसिटिलेशन या संक्षिप्तीकरण के लिए साइट-स्तरीय मात्रा का आकलन करने वाले प्रायोगिक परिणामों का विश्लेषण किया। इसके अतिरिक्त, स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण(चित्रा 2सी, डी)ने दिखाया कि एक-पॉट पीटीएम संवर्धन ने एकल-पीटीएम संवर्धन कार्यप्रवाह के समान प्रदर्शन किया। यह पेप्टाइड और खंड स्तर के सहसंबंधों के लिए भी सच था । धारावाहिक-पीटीएम संवर्धन के साथ एक बर्तन की तुलना करते समय एक ही अवलोकन सभी तीन सहसंबंधों के लिए आयोजित किया गया ।
यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को त्वरित और लागत प्रभावी तरीके से पीटीएम क्रॉसटॉक में आकर्षक जैविक अंतर्दृष्टि बनाने की अनुमति देता है। कार्यप्रवाह का व्यास घटक शोधकर्ताओं को पीटीएमएस के बारे में अधिक समझने की अनुमति देता है, क्योंकि यह साइट स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है और पीटीएमएस की कम साइट अधिभोग जैसी चुनौतियों पर काबू पा जाता है । अग्रदूत आयनों को डीडीए के साथ बाहर रखा जाता है, जो पीटीएमएस का अध्ययन करते समय विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि साइट अधिभोग अक्सर उस बिंदु पर कम होता है जहां ये पेप्टाइड्स एमएस/एमएस के लिए चयनित नहीं होते हैं लेकिन अभी भी महत्वपूर्ण जानकारी होती है । इस विधि का उपयोग करके एक साथ कितने पीटीएमएस को समृद्ध किया जा सकता है, इसकी ऊपरी सीमा का आकलन करने के लिए अनुवर्ती प्रयोग किए जा सकते हैं। इस कार्यप्रवाह के भविष्य में सुधार में साइट स्थानीयकरण और पीटीएम साइट अधिभोग के विश्लेषण को और अधिक स्वचालित करने के लिए अधिक उन्नत सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों का विकास शामिल हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम बक इंस्टीट्यूट (1S10 OD016281) में TripleTOF प्रणाली के लिए एनआईएच साझा इंस्ट्रूमेंटेशन ग्रांट से समर्थन स्वीकार करते हैं। इस काम को राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान (R01 AI108255 से बी.एस.) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (आर 24 डीके085610 से एरिक वर्डिन) द्वारा भी समर्थन दिया गया था; R01 DK090242 एरिक Goetzman करने के लिए) । एक्स एक्स को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच ग्रांट T32GM8806, जूडिथ कैम्पिसी और लिसा एलेर्बी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, एनबीए को ग्लेन फाउंडेशन फॉर मेडिकल रिसर्च से पोस्टडॉक्टोरल फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |