Caractérisation des changements conformationnels à molécule unique sous le flux de cisaillement avec microscopie fluorescence
Summary
Nous présentons un protocole pour immobiliser les macromolécules simples dans les dispositifs microfluidiques et quantifier les changements dans leurs conformations sous le flux de cisaillement. Ce protocole est utile pour caractériser les propriétés biomécaniques et fonctionnelles des biomolécules telles que les protéines et l’ADN dans un environnement de flux.
Abstract
Le comportement d’une seule molécule sous perturbation mécanique a été caractérisé largement pour comprendre beaucoup de processus biologiques. Cependant, des méthodes telles que la microscopie de force atomique ont une résolution temporelle limitée, tandis que le transfert d’énergie de résonance (FRET) ne permet que d’inférer des conformations. La microscopie de fluorescence, d’autre part, permet la visualisation in situ en temps réel de molécules uniques dans diverses conditions de débit. Notre protocole décrit les étapes pour capturer les changements conformationnels des biomolécules simples sous différents environnements de flux de cisaillement utilisant la microscopie de fluorescence. Le flux de cisaillement est créé à l’intérieur des canaux microfluidiques et contrôlé par une pompe à seringues. Comme démonstrations de la méthode, le facteur von Willebrand (VWF) et l’ADN lambda sont étiquetés avec de la biotine et du fluorophore, puis immobilisés sur la surface du chenal. Leurs conformations sont surveillées en permanence sous le flux variable de cisaillement à l’aide d’une réflexion interne totale (TIRF) et d’une microscopie à fluorescence confocale. La dynamique réversible de démêler de VWF sont utiles pour comprendre comment sa fonction est régulée dans le sang humain, tandis que la conformation de l’ADN lambda offre un aperçu de la biophysique des macromolécules. Le protocole peut également être largement appliqué pour étudier le comportement des polymères, en particulier les biopolymères, dans des conditions d’écoulement variables et pour étudier la rhéologie des fluides complexes.
Introduction
Les mécanismes de la façon dont les biomolécules réagissent aux stimuli environnementaux ont été largement étudiés. Dans un environnement d’écoulement en particulier, les forces de cisaillement et d’allongement régulent les changements conformationnels et potentiellement la fonction des biomolécules. Les exemples typiques incluent le dénouement induit par le cisaillement de l’ADN lambda et du facteur von Willebrand (VWF). Lambda DNA a été utilisé comme un outil pour comprendre la dynamique conformationnelle des chaînes individuelles et flexibles polymères et la rhéologie des solutions polymères1,2,3,4. VWF est un capteur d’écoulement naturel qui agrége les plaquettes sur les sites de plaies des vaisseaux sanguins avec des taux de cisaillement anormaux et des schémas de débit. Le dénouement de la VWF est essentiel pour activer la reliure des plaquettes au domaine A1 et la liaison au collagène au domaine A3. En outre, le déploiement du domaine A2 induit par le cisaillement élevé permet le clivage de VWF, qui régule sa répartition du poids moléculaire en circulation5,6. Ainsi, la visualisation directe de la façon dont ces molécules se comportent sous le flux peut grandement améliorer notre compréhension fondamentale de leur biomécanique et de leur fonction, ce qui peut permettre de nouvelles applications diagnostiques et thérapeutiques.
Les méthodologies typiques pour caractériser les conformations d’une seule molécule comprennent les pinces optiques/magnétiques, la microscopie de force atomique (AFM) et le transfert d’énergie de résonance à molécule unique (FRET)7. La spectroscopie de force à molécule unique est un outil puissant pour étudier la force et le mouvement associés aux changements conformationnels des biomolécules. Cependant, il n’a pas la capacité de cartographier les conformations moléculaires globales8. L’AFM est capable d’imagerie avec une haute résolution spatiale, mais est limitée dans la résolution temporelle9,10. De plus, le contact entre la pointe et l’échantillon peut confondre la réponse induite par le débit. D’autres méthodes comme le FRET et l’analyse des nanopores déterminent le pliage et le développement des protéines monomolécules en fonction de la détection de la distance intramoléculaire et des volumes exclus. Cependant, ces méthodes sont encore à leurs balbutiements et limitées dans leur observation directe des conformations monomolécules11,12,13,14.
D’autre part, l’observation directe des macromolécules à haute résolution temporelle et spatiale sous microscopie fluorescence a amélioré notre compréhension de la dynamique d’une seule molécule dans de nombreux processus biologiques15,16. Par exemple, Fu et coll. ont récemment réalisé la visualisation simultanée de l’allongement de la VWF et de la liaison des récepteurs plaquettaires pour la première fois. Dans leur travail, les molécules de VWF ont été immobilisées à la surface d’un canal microfluidique par des interactions biotin-streptavidin et représentées sous la microscopie de fluorescence interne totale (TIRF) à des environnements de flux de cisaillement variables17. En appliquant une méthode similaire à celle de Fu, nous démontrons ici que les conformations de l’ADN de VWF et de lambda peuvent être directement observées sous la microscopie de fluorescence de TIRF et de fluorescence confocale. Comme le montre la figure 1, des dispositifs microfluidiques sont utilisés pour créer et contrôler le flux de cisaillement, et les biomolécules sont immobilisées à la surface du chenal. Lors de l’application de différents taux de cisaillement, des conformations d’une même molécule sont enregistrées pour mesurer la longueur d’extension, également indiquée à la figure 1. La méthode pourrait être largement appliquée pour explorer d’autres comportements polymères dans des environnements d’écoulement complexes pour des études rhéologiques et biologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour obtenir des données de haute qualité sur les changements conformationnels à molécule unique à l’aide de la microscopie de fluorescence décrite dans cette méthode, il est essentiel d’incuber la molécule pendant le temps approprié, de minimiser ses interactions non spécifiques avec la surface et établir des réglages de microscope qui réduisent le photoblanchiment. La capacité de la molécule à modifier librement la conformation est liée au nombre d’interactions biotine-streptavidine formées entre la m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de la National Science Foundation DMS-1463234, national Institutes of Health subventions HL082808 et AI133634, et le financement interne de l’Université Lehigh.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
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