Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Immobilisierung einzelner Makromoleküle in mikrofluidischen Geräten und zur Quantifizierung von Veränderungen in ihren Konformationen unter Scherfluss. Dieses Protokoll ist nützlich, um die biomechanischen und funktionellen Eigenschaften von Biomolekülen wie Proteinen und DNA in einer Strömungsumgebung zu charakterisieren.
Abstract
Das Verhalten von Einzelmolekülen unter mechanischer Störung wurde weithin charakterisiert, um viele biologische Prozesse zu verstehen. Methoden wie die Atomkraftmikroskopie haben jedoch eine begrenzte zeitliche Auflösung, während Förster Resonanzenergieübertragung (FRET) nur die Ableitung von Konformationen zulässt. Die Fluoreszenzmikroskopie hingegen ermöglicht die Echtzeit-In-situ-Visualisierung einzelner Moleküle unter verschiedenen Strömungsbedingungen. Unser Protokoll beschreibt die Schritte zur Erfassung von konformen Veränderungen einzelner Biomoleküle in verschiedenen Scherflussumgebungen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Der Scherstrom wird in mikrofluidischen Kanälen erzeugt und über eine Spritzenpumpe gesteuert. Als Demonstrationen der Methode werden von Willebrand-Faktor (VWF) und Lambda-DNA mit Biotin und Fluorophor gekennzeichnet und dann auf der Kanaloberfläche immobilisiert. Ihre Konformationen werden unter variablem Scherstrom kontinuierlich mit Derinkintheitierreflexion (TIRF) und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie überwacht. Die reversible Entwirrungsdynamik von VWF ist nützlich, um zu verstehen, wie seine Funktion im menschlichen Blut reguliert wird, während die Konformation der Lambda-DNA Einblicke in die Biophysik von Makromolekülen bietet. Das Protokoll kann auch weit verbreitet werden, um das Verhalten von Polymeren, insbesondere Biopolymeren, unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen zu untersuchen und die Rheologie komplexer Flüssigkeiten zu untersuchen.
Introduction
Mechanismen, wie Biomoleküle auf Umweltreize reagieren, wurden umfassend untersucht. Insbesondere in einer Strömungsumgebung regulieren Scher- und Dehnungskräfte die Konformationsveränderungen und potenziell die Funktion von Biomolekülen. Typische Beispiele sind das scherinduzierte Entwirren der Lambda-DNA und der von Willebrand-Faktor (VWF). Lambda DNA wurde als Werkzeug verwendet, um die konforme Dynamik einzelner, flexibler Polymerketten und die Rheologie von Polymerlösungen1,2,3,4zu verstehen. VWF ist ein natürlicher Strömungssensor, der Blutplättchen an Wundstellen von Blutgefäßen mit abnormalen Scherraten und Strömungsmustern aggregiert. Die Auflösung von VWF ist für die Aktivierung der Bindung von Thrombozyten an die A1-Domäne und der Kollagenbindung an den A3-Bereich unerlässlich. Darüber hinaus ermöglicht die hochscherinduzierte A2-Domänenentfaltung die Spaltung von VWF, das seine Molekulargewichtsverteilung im Umlaufreguliert 5,6. Die direkte Visualisierung des Verhaltens dieser Moleküle unter fließendem Fluss kann unser grundlegendes Verständnis ihrer Biomechanik und Funktion erheblich verbessern, was wiederum neuartige diagnostische und therapeutische Anwendungen ermöglichen kann.
Typische Methoden zur Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationen sind optische/magnetische Pinzette, Atomkraftmikroskopie (AFM) und einmolekulare Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET)7. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Kraft und Bewegung zu untersuchen, die mit den konformen Veränderungen von Biomolekülen verbunden sind. Es fehlt jedoch die Fähigkeit, allgemeine molekulare Konformationen8abzubilden. AFM ist in der Lage, Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung, ist aber in der zeitlichen Auflösung9,10begrenzt. Darüber hinaus kann der Kontakt zwischen der Spitze und der Probe die durch den Durchfluss induzierte Reaktion verwirren. Andere Methoden wie FRET und Nanopore Analytics bestimmen die Faltung und Entfaltung von Einzelmolekülproteinen auf der Grundlage des Nachweises von intramolekularer Entfernung und ausgeschlossenen Volumina. Diese Methoden stecken jedoch noch in den Kinderschuhen und sind in ihrer direkten Beobachtung der Einzelmolekül-Konformationen11,12,13,14begrenzt.
Andererseits hat die direkte Beobachtung von Makromolekülen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung unter Fluoreszenzmikroskopie unser Verständnis der Einzelmoleküldynamik in vielen biologischen Prozessenverbessert 15,16. So haben Fu et al. kürzlich erstmals eine gleichzeitige Visualisierung der VWF-Dehnung und der Thrombozytenrezeptorbindung erreicht. In ihrer Arbeit wurden VWF-Moleküle auf der Oberfläche eines mikrofluidischen Kanals durch Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen immobilisiert und unter totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) in unterschiedlichen Scherflussumgebungen abgebildet17. Mit einer ähnlichen Methode wie Fu zeigen wir hier, dass Konformationen von VWF- und Lambda-DNA sowohl unter TIRF- als auch in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie direkt beobachtet werden können. Wie in Abbildung 1dargestellt, werden mikrofluidische Vorrichtungen verwendet, um den Scherfluss zu erzeugen und zu steuern, und Biomoleküle werden auf der Kanaloberfläche immobilisiert. Bei Anwendung unterschiedlicher Scherraten werden Konformationen desselben Moleküls aufgezeichnet, um die Verlängerungslänge zu messen, siehe auch abbildung 1. Die Methode könnte weit verbreitet angewendet werden, um andere Polymerverhalten unter komplexen Strömungsumgebungen sowohl für rheologische als auch für biologische Studien zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um qualitativ hochwertige Daten von konbildenden Veränderungen einzelner Moleküle mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu erhalten, wie in dieser Methode beschrieben, ist es wichtig, das Molekül für die entsprechende Zeit zu inkubieren, seine unspezifischen Wechselwirkungen mit der Oberfläche zu minimieren. und stellen Sie Mikroskopeinstellungen ein, die das Photobleichen reduzieren. Die Fähigkeit des Moleküls, die Konformation frei zu verändern, hängt mit der Anzahl der Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen zusam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch eine Nationale Wissenschaftsstiftung unterstützt, die DMS-1463234, die Nationalen Gesundheitsinstitute HL082808 und AI133634 und die interne Finanzierung der Lehigh University gewährt.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
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