우리는 미세 유체 장치에서 단일 거대 분자를 고정시키고 전단 흐름하에서 적합성의 변화를 정량화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 유동 환경에서 단백질 및 DNA와 같은 생체 분자의 생체 역학 적 및 기능적 특성을 특성화하는 데 유용합니다.
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방법 논문
형광 현미경으로 전단 흐름 하에서 단일 분자 변형 특성화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
기계적 섭동 하에서 단일 분자 거동은 많은 생물학적 과정을 이해하는 것이 널리 특징지어졌다. 그러나, 원자력 현미경 검사법과 같은 방법은 시간적 분해능이 제한되어 있는 반면, Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 적합성만 유추할 수 있습니다. 형광 현미경 검사법은, 다른 한편으로는, 각종 교류 조건에 있는 단 하나 분자의 situ 가시화에서 실시간 허용합니다. 우리의 프로토콜은 형광 현미경 검사법을 사용하여 다른 전단 흐름 환경에서 단일 생체 분자의 형태 변화를 포착하는 단계를 설명합니다. 전단 흐름은 미세 유체 채널 내부에서 생성되며 주사기 펌프에 의해 제어됩니다. 방법의 데모로, 폰 윌레브란트 인자 (VWF) 및 람다 DNA는 비오틴과 플루오로포어로 표지된 다음 채널 표면에 고정됩니다. 이들의 적합성은 총 내부 반사(TIRF) 및 공초점 형광 현미경 을 사용하여 가변 전단 흐름 하에서 지속적으로 모니터링됩니다. VWF의 가역적 해명 역학은 그 기능이 인간의 혈액에서 어떻게 조절되는지 이해하는 데 유용하며 람다 DNA의 형태는 거대 분자의 생물 물리학에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 유동 조건에서 폴리머, 특히 생체 고분자의 거동을 연구하고 복잡한 유체의 유변학을 조사하기 위해 널리 적용될 수 있습니다.
서론
생체 분자가 환경 자극에 반응하는 방식의 메커니즘은 널리 연구되었습니다. 특히 유동 환경에서 전단 및 연신력은 형태 변화와 잠재적으로 생체 분자의 기능을 조절합니다. 대표적인 예로는 람다 DNA 및 폰 윌레브란트 인자(VWF)의 전단 유도 해명이 있다. 람다 DNA는 개별, 유연한 폴리머 사슬의 형태 역학 및 폴리머 용액1,2,3,4의변성학을 이해하는 도구로 사용되어 왔다. VWF는 비정상적인 전단 속도 및 흐름 패턴으로 혈관의 상처 부위에 혈소판을 응집시키는 자연 유량 센서입니다. VWF의 해명은 A1 도메인에 혈소판의 결합을 활성화하고 A3 도메인에 결합하는 콜라겐을 활성화시키는 데 필수적이다. 또한, 높은 전단 유도 A2 도메인 전개는 순환5,6에서분자량 분포를 조절VWF의 분열을 허용한다. 따라서, 이 분자가 흐름의 밑에 어떻게 작동하는지의 직접적인 시각화는 그(것)들의 생체 역학 및 기능에 대한 우리의 근본적인 이해를 크게 향상할 수 있고, 이는 차례차....
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프로토콜
1. VWF 준비
- 인간 플라즈마 VWF를 재구성하여 라벨링 반응을 준비합니다. 1mg/mL VWF 스톡 솔루션을 만들기 위해 100 μL의 탈이온화(DI) 물을 100 μg의 동열VWF에 추가합니다.
- 초과 글리신을 제거하기 위해 VWF 스톡 솔루션을 투석하여 비오틴 및 플루오로포어 라벨링 효율을 높입니다.
- VWF 스톡 솔루션 50 μL을 0.1 mL 투석 장치로 10,000 분자량 컷오프 및 캡으로 밀봉합니다. 남은 재고 용액을 -20 °C에 보관하십시오. VWF 재고는 -20 °C에서 최대 1 년 동안 안정될 것입니다.
- 투석을 500 mL의 1x 멸균 인산완충식염수(PBS)(0.01 M 디소듐 인산염, 0.0018 모노포타슘 인산염, 0.0027 M 염화칼륨, 염화나트륨 염화나트륨, pH 7.4°C 에서 25°C)에서 25°C에서 25°C에서 투석을 실행합니다. 신선한 PBS 500 mL를 사용하여 추가 시간 동안 투석을 반복하십시오.
- 비오틴 라벨링 반응을 시작합니다. 반응 직전에 DI 물에서 고체를 용해시킴으로써 NHS-PEG 4-비오틴의 2 mM 용액을 준비한다. NHS-PEG4-비오틴이 장시간 물에 남아 있게 하면 NHS-에스테르 그룹이....
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결과
VWF 및 람다 DNA와 같은 생체 분자의 동적 거동을 관찰하는 것은 장치 표면에 대한 결합을 최적화하는 데 크게 의존합니다. 미세 유체 장치에서 권장 시간 동안 표면 처리를 배양하는 것은 분자가 변화하는 흐름에 따라 자유롭게 확장하고 릴렉스 할 수 있도록 몇 가지 앵커리지 포인트와 결합을 얻는 데 중요합니다. 단백질 또는 DNA가 다중 연결로 너무 강하게 결합되는 경우에, 그(것)들은 한정된 길이로 연장하거나 전혀 확장되지 않을 것입니다. 이는 특히 VWF가 자유 비오틴 차단 전에 3분 이상 장치 표면에 흐르지 않고 남아 있을 때 발생합니다. 폭스바겐F가 표면에 정체된 상태로 오래 지속될수록, 더 많은 VWF 비오틴 그룹이 표면 스트렙타비딘 그룹에 결합하고 분자가 해명할 수 있는 유연성이 줄어듭니다. 분자가 너무 약하게 결합되면, 다른 한편으로는, 그(것)들은 교류에 따라 분리하고 보기에서 사라집니다. 이것은 VWF 또는 람다 DNA가 너무 짧은 기간 동안 배양되는 경우에 생길 수 있습니다, 양식에 너무 적은 비오틴 연쇄상 구.......
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토론
이 방법에 설명된 바와 같이 형광 현미경을 사용하여 단일 분자 구성 변화의 고품질 데이터를 얻으려면 적절한 시간 동안 분자를 배양하고 표면과의 비특이적 상호 작용을 최소화하는 것이 중요합니다. 그리고 광 표백을 줄이는 현미경 설정을 설정합니다. 자유롭게 변형을 변경하는 분자의 능력은 분자와 표면 사이에 형성 된 비오틴 스트렙타비딘 상호 작용의 수와 관련이 있습니다. 앞서 언급했듯이, 이것은 적절한 시간 동안 유동없이 분자를 배양함으로써 조절되어야 한다. 추가적으로, 단백질 DNA는 커버슬립이 효과적으로 막이지 않는 경우에 커버슬립에 비특이적으로 결합할 수 있습니다. 권장 차단 솔루션이 없으면 분자가 유리에 비특이적으로 부착될 수 있으며 적용된 유량에 반응하지 않을 수 있습니다. 초기 표면 처리 중에 카제인 블록을 적용하고 유동 중에 그 존재를 유지하는 것은 이러한 비특이적 상호 작용을 감소시키는 데 필수적입니다. 마지막으로, 단일 분자의 연속적인 동적 동작을 캡처하려면 이미지 캡처 중에 형광포극이 자주 발생합니다. 레이저 강도,.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 과학 재단 보조금 DMS-1463234, 건강의 국립 연구소 보조금 HL082808 및 AI133634, 및 리하이 대학 내부 자금에 의해 부분적으로 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 라벨링 키트 | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 겔 컬럼 | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | 단계에서 유리 비오틴으로 사용 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP 미니 | Invitrogen | 10297018 | |
| 플로트 부표 | 세트 Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→ 5' 엑소-) | New England BioLabs | M0212S | 2.1.1단계에서 10X 반응 완충액 사용 및 2.2.2단계에서 1X 반응 완충액 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL 용량 |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| PDMS 제조용 실리콘 엘라스토머 키트 | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| 차단 솔루션 | CANDOR Bioscience | 110 050 | 프로토콜 전반에 걸쳐 카제인 차단 솔루션으로 사용 |
| 비닐 클린룸 테이프 | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm 내경 튜빙 | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 게이지 니들 | 토마스 사이언티픽 | JG2505X |
참고문헌
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C.,....
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재인쇄 및 허가
