En intravital mikroskopi-baseret tilgang til vurdering af intestinal permeabilitet og epitelcelle shedding performance
Summary
Drage fordel af intravital mikroskopi, den metode, der præsenteres her gør det muligt real-time visualisering af intestinal epitelcelle udgydelse i levende dyr. Derfor, topisk plettet tarmslimhinden (acriflavine og rhodamineB-dextran) af bedøvede mus er afbildet op til encellet opløsning ved hjælp af konfokal mikroskopi.
Abstract
Intravital mikroskopi af tarmen ved hjælp af konfokale billeddannelse giver realtid observation af epitelcelle udgydelse og barriere lækage i levende dyr. Derfor er tarmslimhinden af bedøvede mus topisk plettet med uspecifik farvning (acriflavine) og en fluorescerende sporstof (rhodamine-B dextran), monteret på en saltvandsopløsning-skyllet plade og direkte afbildet ved hjælp af et konfokal mikroskop. Denne teknik kan supplere andre ikke-invasive teknikker til at identificere lækage af intestinal permeabilitet, såsom transmucosal passage af oralt administrerede tracer… Ud over dette, den tilgang, der præsenteres her giver mulighed for direkte observation af celle kaste begivenheder i realtid. I kombination med passende fluorescerende reporter mus, denne fremgangsmåde er velegnet til at kaste lys i cellulære og molekylære mekanismer, der styrer intestinal epitelcelle ekstrudering, samt til andre biologiske processer. I de sidste årtier har interessante undersøgelser ved hjælp af intravital mikroskopi bidraget til viden om endotelperabilitet, immuncelle gut homing, immun-epitel kommunikation og invasion af luminal komponenter, blandt andre. Sammen vil den protokol, der præsenteres her, ikke blot bidrage til at øge forståelsen af mekanismer, der styrer epitelcelleudtrudering, men også kunne danne grundlag for udvikling af andre tilgange, der skal anvendes som instrumenter til at visualisere andre meget dynamiske cellulære proces, selv i andre væv. Blandt de tekniske begrænsninger, optiske egenskaber af det specifikke væv, samt den valgte billeddannelse teknologi og mikroskop konfiguration, ville igen, bestemme billeddannelse arbejdsafstand, og opløsning af erhvervede billeder.
Introduction
Tarmen er et højt specialiseret organ med en stramt reguleret funktion, der muliggør modstridende processer, nemlig ernæring og beskyttelse mod skadelige luminalstoffer. Foring mellem den menneskelige krop og miljøet, tarmepitel fungerer som en fysisk og immunologisk barriere og bidrager til opretholdelsen af slimhinde homøostase itarmen 1,,2. Tab af epitelintegritet og øget tæt vejkrydspermeabilitet er velkendt for at være forbundet med inflammatorisk tarmsygdom (IBD)3,4,5,6. Epitelændringer betragtes derefter som årsager og sekundære forstærkere til kronisk tarmbetændelse i IBD. Således, en forbedret forståelse af tidlige epitelændringer i tarmen af IBD patienter ville være af enorm værdi for udviklingen af nye strategier til at genoprette epitelintegritet for pålidelig forudsigelse og efterfølgende forebyggelse af IBD tilbagefald.
Intestinal epitel følger en kompleks og stramt reguleret omsætningsproces. Fra kryptbunden, terminalt differentierede tarm epitelceller (IEC’ er) stammer fra pluripotente stamceller migrere opad til villus spids, hvor alderen / beskadigede celler er kastet i lumen7. Ligevægten mellem deling og celle ekstrudering gør det muligt at opretholde tarm epitelcelletal, undgå dannelsen af huller og lækage, samt ophobning af epitelceller potentielt fører til cellemasser og tumorigenesis8,9,10. På trods af den centrale rolle epitelcelleudsedeling i den fysiologiske fornyelse af tarmepitelet er kendskabet til de molekylære mekanismer, der driver ekstruderingen af celler på villus-spidsen, begrænset. Der er således behov for grundforskning, der giver en præcis beskrivelse af rækkefølgen af molekylære hændelser, der er involveret i epitelcelleudgydelse.
Komplekse interaktioner mellem forskellige celletyper i tarmslimhinden er nøglen til at forstå de molekylære mekanismer, der regulerer epitelomsætning og tarmhomøostase. In vivo-undersøgelser giver således store fordele i forhold til in vitro- og ex vivo-tilgange i denne sammenhæng. Desuden giver realtidsbilleddannelsesteknikker mulighed for beskrivelse af rækkefølgen af begivenheder, der styrer specifikke fænomener. I denne sammenhæng kræver studiet af meget dynamiske processer brugen af optimerede højopløsningsteknikker til direkte observation af vævet. Intravital billeddannelse teknikker fremstå som unikke egnede værktøjer til undersøgelse af epitelcelle kaste i tarmen.
Udtrykket “intravital mikroskopi” henviser til eksperimentelle tilgange, der udnytter billedbehandlingsteknikker med høj opløsning (multiphoton eller konfokal mikroskopi) til direkte at visualisere celler og væv i deres oprindelige omgivelser i et levende dyr11. Det muliggør realtidserhvervelse af in vivo-oplysninger op til encelleløsning og medfører klare fordele i forhold til statiske eller lave opløsningsmetoder. Intravital mikroskopi giver supplerende oplysninger og overvinde nogle begrænsninger fra klassiske og / eller high-end teknikker, såsom artefakter på grund af vævsbehandling. I modsætning hertil er den vigtigste begrænsning af intravital mikroskopi, at vævet skal være direkte udsat for mikroskopet, som i de fleste tilfælde kræver operation. Selv om sofistikerede tilgange bevare vitalitet og minimere virkningen af det afbildede væv (skinfold kamre og billeddannelse vinduer)12,13, i de fleste tilfælde en simpel hud snit udføres for eksternalisering af vævet (hud flapper)14. I det seneste årti har disse tilgange bidraget med nøglevidne om meget dynamiske processer, som tidligere var uudgrundelige. Translationelt, real-time billeddannelse forudsat nye biologiske indsigter på stamceller og leukocytter homing15, samt kræft formidling og metastasedannelse 13,16. I den kliniske sammenhæng udnyttes endomikroskopi i øjeblikket som et diagnostiskværktøj for kræft 17 og gastrointestinale sygdomme, såsom IBD18,19; mens konfokale mosaicking mikroskopi blev en hurtig patologi værktøj under kirurgi20. Sammen har intravital mikroskopi på det seneste vist sig som et værdifuldt og alsidigt værktøj til biomedicinsk forskning og fremtidig anvendelse i klinikken.
Intravital mikroskopi er her implementeret for real-time visualisering af intestinal epitellækage og observation af epitelcelle kaste begivenheder. Udsivning af intestinal gennemtrængelighed kan identificeres ved hjælp af andre in vivo noninvasive teknikker, såsom kvantificering af mundtlig administration af fluorescerende stoffer i serum21. Denne teknik gør det imidlertid ikke muligt at foretage direkte observation af udskillelsen af ydeevnen eller adskillelsen mellem para- og transcellulær permeabilitet. Kombinationen af standardsporingsforsøg og intravital mikroskopi repræsenterer en passende tilgang til: i) identificere forstyrrelser i tarmpermeabilitet og ii) adskille mellem para- og transcellulære epitelperabilitet. Ud over celleudgydelse muliggør intravital mikroskopi i kombination med in vivo fluorescensmærkning studiet af andre cellulære og molekylære mekanismer (f.eks. tæt krydsfordeling under celleudgydelse ved hjælp af fluorescerende reportermus22 eller interaktioner mellem IEC’er og andre celler i tarmslimhinden23).
Den metode, der præsenteres her, repræsenterer en tilpasning af intravital mikroskopi for at muliggøre real-time observation af tarmslimhinden ved hjælp af konfokal laserscanningmikroskopi (CLSM). Derfor bruger vi betingede knock-out mus af GGTase (Geranylgeranyltransferase) i intestinal epitelceller (IEC’ er) i (Pggt1biΔIEC mus), da de lider af en alvorlig tarmsygdom og øget epitelperabilitet24. Kirurgisk forberedelse af musen og farvning af tarmslimhinden, samt passende indstillinger, der anvendes til billeddannelse erhvervelse og post-erhvervelse analyse er beskrevet. Denne protokol kan muliggøre fremtidige undersøgelser, der bidrager til den nuværende viden om dynamik og kinetik af intestinal epitelcelleudgydelse. Desuden kunne protokollen danne grundlag for forskellige tilpasninger for at undersøge andre fænomener, der forekommer på overfladen af tarmslimhinden, og selv på andre væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om teknisk udfordrende, intravital mikroskopi-baseret metode repræsenterer en unik eksperimentel tilgang til at visualisere meget dynamisk cellulære proces i realtid, såsom celle kaste ydeevne. Hidtil er der ingen alternativ eksperimentel tilgang til visualisering celle ekstrudering in vivo. Vi mener, at denne protokol kan bidrage til beskrivelsen af forskellige cellulære processer, der spiller en rolle i vedligeholdelsen af tarmhomostase.
Drage fordel af intravital mikroskopi, den me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den forskning, der fører til disse resultater, har modtaget støtte fra People Program (Marie Curie-aktionerne) under REA-tilskudsaftalen nummer 302170 i Eu’s syvende rammeprogram (RP7/2007-2013); det tværfaglige Center for Klinisk Forskning (IZKF) ved Universitetet Erlangen-Nürnberg; Det Kollaborative Forskningscenter TRR241 og den kliniske forskningsgruppe KFO257 fra det tyske forskningsråd (DFG); og DFG.
Materials
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | – |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | – |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | – | – |
| LSM microscope SP8 | Leica | – | – |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | – |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | – |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn’s disease: role of CARD15 3020insC mutation?. Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn’s disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn’s disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!. Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
