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생체공학

In Vitro 인간 섬유아세포 확장을 촉진하기 위한 자가 혈소판 풍부 혈장 생산

Published: February 24, 2021
doi:
10.3791/60816
, ,
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine,Geneva University, 2Regen Lab SA

Summary

이 프로토콜은 100% 자가 섬유아세포 배양 시스템에서 세포의 시험관 내 확장을 촉진하기 위해 PRP를 생성하는 장치를 제시합니다.

Abstract

현재 피부 복구를 위한 자가 섬유아세포의 사용에 대한 임상적 관심이 크다. 대부분의 경우 시험관 내에서 피부 세포의 배양이 필요합니다. 그러나, 이종 또는 동종 배양 배지를 사용하는 세포 배양은 몇 가지 단점(즉, 감염원 전파 또는 느린 세포 확장의 위험)을 갖는다. 여기서, 환자 자신의 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 이용하여 체외에서 인간 피부 섬유아세포의 확장을 위한 자가 배양 시스템을 개발한다. 인간 진피 섬유아세포는 복부 성형술을 받는 동안 환자로부터 분리됩니다. 배양은 소 태아 혈청(FBS) 또는 PRP가 보충된 배지를 사용하여 최대 7일 동안 추적됩니다. PRP 제제의 혈구 함량, 증식 및 섬유아세포 분화를 평가합니다. 이 프로토콜은 전용 의료 기기를 사용하여 PRP의 표준화된 비활성 제제를 얻는 방법을 설명합니다. 준비에는 의료 기기 (CuteCell-PRP)와 원심 분리기 만 있으면됩니다. 이 장치는 충분한 의료 행위 조건에서 적합하며 5분 동안 1,500 x g 의 단일 소프트 스핀 원심분리가 필요한 원스텝, 발열성 및 멸균 폐쇄 시스템입니다. 원심 분리 후 혈액 성분이 분리되고 혈소판이 풍부한 혈장이 쉽게 수집됩니다. 이 장치를 사용하면 인간 세포의 시험관 내 확장을 위한 세포 배양 보충제로 사용할 수 있는 PRP를 빠르고 일관되며 표준화된 제조가 가능합니다. 여기서 얻은 PRP는 전혈에 비해 혈소판 농도가 1.5 배 더 높으며 적혈구와 백혈구가 우선적으로 제거됩니다. PRP는 FBS(7.7배)에 비해 세포 증식 촉진 효과를 나타내며 PRP 치료 시 섬유아세포가 활성화되는 것으로 나타났습니다.

Introduction

재생 의학은 나이, 질병 또는 외상으로 손상된 조직과 기관을 치유하거나 대체하고 선천적 결함을 교정하는 것을 목표로 합니다. 자가 요법에서는 세포나 조직을 환자에게서 빼내어 확장하거나 변형한 다음 기증자에게 다시 도입합니다. 이러한 형태의 치료제는 피부과 분야에서 광범위한 잠재력을 가지고 있다1. 자가 섬유아세포 치료에서는 환자의 섬유아세포를 배양하고 재주입하여 주름, 백합 또는 여드름 흉터를 치료합니다. 섬유아세포는 진피의 주요 기능세포이기 때문에 자가 섬유아세포 주사는 안면 회춘에 다른 치료법보다 더 유익할 수 있다2.

피부에서 섬유아세포는 세포외 단백질(즉, 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 및 글리코사미노글리칸)의 합성 및 분비를 담당합니다. 또한 정상적인 피부 항상성 및 상처 치유에서 세포 기능, 이동 및 세포-기질/세포-세포 상호작용을 조절하는 성장 인자를 방출합니다3. 피부 섬유아세포는 피부 상처 치유를 위한 잠재적인 임상 세포 치료제로 이미 소개되었다.4, 조직 재생5 또는 심미와 성형 수술에서 피부 필러6. 일부 연구에서는 재생 의학의 맥락에서 섬유아세포가 중간엽 줄기세포보다 더 실용적이고 효과적인 세포 치료제가 될 수 있다고 제안하기도한다 7.

임상 적용을 위해 충분한 수의 섬유아세포를 얻으려면 일반적으로 세포 확장이 필수입니다. 생체 외/체외 세포 배양에는 세포 부착 및 증식을 지원하기 위해 성장 인자, 단백질 및 효소가 보충된 기본 배지가 필요합니다. 태아 소 혈청(FBS)은 태아 혈액이 1) 성인 혈액에 비해 성장 인자가 풍부하고 2)항체 함량이 낮기 때문에 세포 배양 배지의 일반적인 보충제입니다8. 세포 치료가 진행됨에 따라 FBS가 배양 배지에 첨가되는 고전적인 세포 배양 조건의 안전성에 대한 우려가 있습니다. 더욱이 FBS를 대안으로 대체하는 경향이 있습니다9. 여러 FBS 대체품이 유망한 결과를 보여주었습니다10.

혈소판 풍부 혈장(PRP) 대체품이 여기에서 선택되었으며, 당사는 CuteCell-PRP라는 PRP의 표준화된 제제를 생산하기 위한 의료 기기를 개발했습니다. 이 장치의 의도된 용도는 GMP 조건에서 자가 세포의 시험관 내 확장을 위한 배양 배지 보충제로 사용할 자가 PRP의 준비입니다.

PRP는 혈장 내 농축 혈소판 현탁액으로 정의됩니다. 1) 필요한 혈액의 양, 2) 사용되는 장치 유형 및 3) 원심분리 프로토콜이 다른 수많은 준비 프로토콜이 있기 때문에 결과 혈소판 농도는 혈액 기준선 값보다 약간 높거나 10배 이상까지 다양합니다. 또한 PRP 제제에는 다양한 수준의 적혈구 및 백혈구 오염이 포함되어 있습니다. 따라서 “PRP”라는 용어는 생물학적 구성과 잠재적인 치료 효과가 크게 다른 제품을 설명하는 데 사용됩니다.

대부분의 연구에서 FBS 치환은 (트롬빈 또는 칼슘에 의해) 활성화되는 다양한 농도의 PRP를 사용하여 달성됩니다. 이 인공 활성화는 15 분에서 24 시간11까지 혈소판 성장 인자의 즉각적이고 중요한 방출을 유발합니다. 따라서, 혈소판 활성화는 점진적인 혈소판 탈과립화로부터 성장 인자의 느린 방출이 요구되는 세포 배양에서의 적용에 바람직하지 않은 것으로 여겨진다.

PRP 요법은 농축 혈장에서 자가 혈소판을 준비하는 것을 포함한다12. 최적의 혈소판 농도는 불분명하며 PRP13을 준비하기 위해 광범위한 상용 장치를 사용할 수 있습니다. 이러한 표준화의 부족은 연구 간의 불일치로 인해 발생하며 주사 용량 및 시기에 관한 블랙박스로 이어졌습니다. 이 프로토콜은 100% 자가 생체 외 배양 모델에서 피부 섬유아세포를 확장하기 위해 이 전용 PRP 장치를 사용하여 자가 PRP를 얻는 절차를 설명합니다.

Protocol

연구 프로토콜은 헬싱키 선언을 준수했으며 모든 환자는 연구에 참여하기 전에 서면 동의서를 제공했습니다. 피부 샘플은 제네바 대학 병원 (스위스 제네바)의 성형, 재건 및 미용 외과에서 복부 성형술을받는 건강한 여성에게서 얻습니다. 이 절차는 헬싱키 선언의 원칙을 준수하며 지역 기관 윤리 위원회(프로토콜 #3126)의 승인을 받았습니다. 1. PRP의 제조 …

Representative Results

이 특허 기술은 표준화된 PRP 제제를 생산하는 데 사용되는 간단하고 빠르며 재현 가능한 의료 기기입니다. 1,500 x g 에서 5분 동안 원심분리한 후 정맥 전혈에서 PRP를 제조할 수 있는 원스텝 완전 폐쇄 시스템입니다(분리 젤 기술로 인해). 원심분리 후 얻은 PRP는 젤 아래에 있는 적혈구와 백혈구에서 제거됩니다. 여러 차례 관을 반전시킨 후 겔 위에 있는 혈소판이 혈장에 재현탁되고 PRP를 사?…

Discussion

상처 세포 치료에서 다른 필러 재료에 비해 자가 섬유아세포를 천연 대안으로 사용하면 우수한 생체 적합성, 부작용 최소화, 수확 및 사용 용이성 등의 장점이 있습니다. 그러나 일상적인 임상 환경에서 이러한 치료제를 사용하기 전에 이식 전후에 성장 특징을 확인하고 분리된 섬유아세포의 생물학적 기능과 안전성을 평가하기 위해 적절한 전임상 연구가 필요합니다. 따라서, 분리 과정 직후, 세…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

유세포 분석 데이터에 대한 기술 지원을 해주신 Grégory Schneiter씨에게 감사드립니다. Muriel Cuendet 교수(약리학 실험실, 약학부 및 제네바 대학교)는 Attune 유세포 분석기 및 Cytation 3 고처리량 현미경의 사용을 허용했습니다. Brigitte Pittet 교수에게 과학적 조언을 제공합니다.

Materials

96 well black clear flat bottom BD Falcon 353219 32/case
Cell trace Violet Dye Thermo Fischer Scientific C34557 180 assays
CuteCell PRP Regen Lab SA CC-PRP-3T 3 tubes per package
DAPI Sigma D9542 1 mg
DMEM Gibco 52400-025 500 mL
FBS Gibco 10270106 500 mL
Glutamine 200 mM Gibco 25030024 100 mL
Hematology Counter Sysmex KK-21N
Heparin 5000E Liquemine Drossapharm AG 0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M Gibco 15630-056 100 mL
Liberase DH Roche 5401054001 2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x Gibco 11140-035 100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL Gibco 11360-039 100 mL
Penicillin streptomycin Gibco 15140122 100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488 Molecular Probes A12379 300 units
RPMI Gibco 31966-021 500 mL
Trypsin 1x 0.25% Gibco 25050-014 100 mL
Trypsin EDTA 0.25% Gibco 25200056 100 mL
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Autologous Platelet-rich PlasmaFibroblast ExpansionCell CultureCell TherapyCollagenase/dispaseCentrifugationPRP Preparation

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Berndt, S., Turzi, A., Modarressi, A. Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion. J. Vis. Exp. (168), e60816, doi:10.3791/60816 (2021).
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