Estudando efeitos neurocomportamentais de poluentes ambientais em larvas de zebrafish
Summary
Um protocolo experimental detalhado é apresentado neste artigo para avaliação da toxicidade neurocomportamental de poluentes ambientais utilizando um modelo de larvas de zebrafish, incluindo o processo de exposição e testes para indicadores neurocomportamentais.
Abstract
Nos últimos anos, mais e mais poluentes ambientais têm se mostrado neurotóxicos, especialmente nos estágios iniciais de desenvolvimento dos organismos. Larvas de zebrafish são um modelo preeminente para o estudo neurocomportamental de poluentes ambientais. Aqui, prevê-se um protocolo experimental detalhado para a avaliação da neurotoxicidade dos poluentes ambientais utilizando larvas de zebrafish, incluindo a coleta dos embriões, o processo de exposição, indicadores neurocomportamentais, o processo de teste e análise de dados. Além disso, o ambiente cultural, o processo de exposição e as condições experimentais são discutidos para garantir o sucesso do ensaio. O protocolo tem sido usado no desenvolvimento de drogas psicopáticas, pesquisas sobre poluentes neurotóxicos ambientais, e pode ser otimizado para fazer estudos correspondentes ou ser útil para estudos mecanicistas. O protocolo demonstra um processo de operação claro para estudar efeitos neurocomportamentais em larvas de zebrafish e pode revelar os efeitos de várias substâncias neurotóxicas ou poluentes.
Introduction
Nos últimos anos, mais e mais poluentes ambientais têm sido comprovados neurotóxicos1,2,3,4. No entanto, a avaliação da neurotoxicidade in vivo após a exposição a poluentes ambientais não é tão fácil quanto a da perturbação endócrina ou toxicidade do desenvolvimento. Além disso, a exposição precoce a poluentes, especialmente em doses ambientalmente relevantes, tem atraído cada vez mais atenção nos estudos de toxicidade5,6,7,8.
O zebrafish está sendo estabelecido como um modelo animal adequado para estudos de neurotoxicidade durante o desenvolvimento precoce após a exposição a poluentes ambientais. Zebrafish são vertebrados que se desenvolvem mais rápido do que outras espécies após a fertilização. As larvas não precisam ser alimentadas porque os nutrientes na corção são suficientes para sustentá-las por 7 dias após a fertilização (dpf)9. Larvas saem da corção de ~2 dpf e desenvolvem comportamentos como natação e giro que podem ser observados, rastreados, quantificados e analisados automaticamente utilizando instrumentos de comportamento10,11,12,13 a partir de 3-4 dpf14,15,16,17,18. Além disso, testes de alto nível também podem ser realizados por instrumentos de comportamento. Assim, as larvas de zebrafish são um modelo notável para o estudo neurocomportamental de poluentes ambientais19. Aqui, um protocolo é oferecido usando monitoramento de alta base para estudar a toxicidade neurocomportamental de poluentes ambientais em larvas de zebrafish estímulos leves.
Nosso laboratório estudou a toxicidade neurocomportamental de 2,2′,4,4′-tetrabromodifenídel eter (BDE-47)20,21, 6′-Hydroxy/Methoxy-2,2′,4′-tetra Eter diphenyl deca(BDE-209), chumbo e paraffins clorados comerciais23 usando o protocolo apresentado. Muitos laboratórios também usam o protocolo para estudar os efeitos neurocomportamentais de outros poluentes em larvas ou peixes adultos24,25,26,27. Este protocolo neurocomportamental foi usado para ajudar a fornecer suporte mecanicista mostrando que a exposição de baixa dose ao bisfenol A e a substituição do bisfenol S induziu neurogênese hipotámica prematura em zebrafish embrionário27. Além disso, alguns pesquisadores otimizaram o protocolo para realizar estudos correspondentes. Um estudo recente eliminou a toxicidade do beta amiloide (Aβ) em um modelo de zebrafish fácil e de alto nível usando nanopartículas de ouro revestidas de casein (βCas AuNPs). Mostrou que βCas AuNPs em circulação sistêmica translocou através da barreira hematoencefálica de larvas de zebrafish e seqüendo a β42 intracerebral, provocando toxicidade de uma maneira inespecífica, semelhante a acompanhante, que foi apoiada pela patologia comportamental28.
Locomoção, ângulo de caminho e atividade social são três indicadores neurocomportamentais utilizados para estudar os efeitos da neurotoxicidade das larvas de zebrafish após a exposição a poluentes no protocolo apresentado. A locomoção é medida pela distância de natação das larvas e pode ser danificada após a exposição a poluentes. O ângulo do caminho e a atividade social estão mais intimamente relacionados com a função do cérebro e do sistema nervoso central29. O ângulo do caminho refere-se ao ângulo do caminho do movimento animal em relação à direção de natação30. Oito classes angulares de ~-180°-~+180° estão definidas no sistema. Para simplificar a comparação, seis classes no resultado final são definidas como curvas de rotina (-10° ~0°, 0° ~+10°), curvas médias (-10° ~-90°, +10° ~+90°), e curvas responsivas (-180° ~-90°, +90° ~+180°) de acordo com nossos estudos anteriores21,22. A atividade social de dois peixes é fundamental para o comportamento de esnomas em grupo; aqui uma distância de < 0,5 cm entre duas larvas válidas é definida como contato social.
O protocolo aqui apresentado demonstra um processo claro para estudar efeitos neurocomportamentais nas larvas de zebrafish e fornece uma maneira de revelar os efeitos da neurotoxicidade de várias substâncias ou poluentes. O protocolo beneficiará pesquisadores interessados em estudar a neurotoxicidade dos poluentes ambientais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho fornece um protocolo experimental detalhado para avaliar a neurotoxicidade dos poluentes ambientais usando larvas de zebrafish. Os zebrafish passam pelo processo de embriões a larvas durante o período de exposição, o que significa que o bom cuidado dos embriões e larvas é essencial. Qualquer coisa que afete o desenvolvimento dos embriões e larvas pode influenciar o resultado final. Aqui, o ambiente cultural, o processo de exposição e as condições experimentais são discutidos para garantir o suce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos pelo apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (21876135 e 21876136), pelo Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia da China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), fundação do MOE-Xangai Laboratório-Chave de Saúde Ambiental da Criança (CEH201807-5) e Conselho sueco de Pesquisa (nº 639-2013-6913).
Materials
| 48-well-microplate | Corning | 3548 | Embyros housing |
| 6-well-microplate | Corning | 3471 | Embyros housing |
| BDE-47 | AccuStandard | 5436-43-1 | Pollutant |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Cosolvent |
| Microscope | Olympus | SZX 16 | Observation instrument |
| Pipette | Eppendorf | 3120000267 | Transfer solution |
| Zebrabox | Viewpoint | ZebraBox | Behavior instrument |
| Zebrafish | Shanghai FishBio Co., Ltd. | Tubingen | Zebrafish supplier |
| ZebraLab | Viewpoint | ZebraLab | Behavior software |
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