Studera neurobeteendeeffekter av miljöföroreningar på zebrafisk larver
Summary
Ett detaljerat experimentellt protokoll presenteras i detta dokument för utvärdering av neurobeteendetoxicitet av miljöföroreningar med hjälp av en zebrafisklarver modell, inklusive exponeringsprocessen och tester för neurobehavioral indikatorer.
Abstract
De senaste åren har allt fler miljöföroreningar visat sig vara neurotoxiska, särskilt i de tidiga utvecklingsstadierna av organismer. Zebrafisklarver är en framstående modell för neurobeteendestudien av miljöföroreningar. Här tillhandahålls ett detaljerat experimentellt protokoll för utvärdering av neurotoxicitet en miljöförorening med zebrafisklarver, inklusive insamling av embryon, exponeringsprocessen, neurobeteendeindikatorer, testprocessen och dataanalys. Dessutom diskuteras kulturmiljön, exponeringsprocessen och experimentella förhållanden för att säkerställa analysens framgång. Protokollet har använts i utvecklingen av psykopatiska läkemedel, forskning om miljöneurotoxiska föroreningar, och kan optimeras för att göra motsvarande studier eller vara till hjälp för mekanistiska studier. Protokollet visar en tydlig operation process för att studera neurobehavioral effekter på zebrafisk larver och kan avslöja effekterna av olika neurotoxiska ämnen eller föroreningar.
Introduction
Under de senaste åren har fler och fler miljöföroreningar visat sig vara neurotoxiska1,2,3,4. Bedömningen av neurotoxicitet in vivo efter exponering för miljöföroreningar är dock inte lika lätt som endokrina störningar eller utvecklingstoxicitet. Dessutom har tidig exponering för föroreningar, särskilt vid miljörelevanta doser, rönt ökad uppmärksamhet i toxicitetsstudier5,6,7,8.
Zebrafisk håller på att etableras som en djurmodell som är lämplig för neurotoxicitetsstudier under tidig utveckling efter exponering för miljöföroreningar. Zebrafisk är ryggradsdjur som utvecklas snabbare än andra arter efter befruktning. Larverna behöver inte matas eftersom näringsämnena i chorion är tillräckligt för att upprätthålla dem i 7 dagar postfertilisering (dpf)9. Larver kommer ut från chorion på ~ 2 dpf och utveckla beteenden som simning och svarvning som kan observeras, spåras, kvantifieras och analyseras automatiskt med hjälp av beteendeinstrument10,11,12,13 börjar vid 3-4 dpf14,15,16,17,18. Dessutom kan tester med hög genomströmning också realiseras genom beteendeinstrument. Således zebrafisk larver är en enastående modell för neurobehavioral studie av miljöföroreningar19. Här erbjuds ett protokoll med hjälp av övervakning med hög genomströmning för att studera den neurobeteendemässiga toxiciteten hos miljöföroreningar på zebrafisklarver under ljusstimuli.
Vårt labb har studerat neurobeteendetoxiciteten hos 2,2′,4,4′-tetrabromdifenyleter (BDE-47)20,21, 6′-Hydroxi/Metoxi-2,2′,4,4′-tetrabromdifenyletrer (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-bromerad difenyleter (BDE-209), bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly, bly och kommersiella klorerade paraffiner23 med det protokoll som presenteras. Många laboratorier använder också protokollet för att studera de neurobehavioral effekterna av andra föroreningar på larver eller vuxna fiskar24,25,26,27. Detta neurobehavioral protokoll användes för att ge mekanistiskt stöd som visar att låg dos exponering för bisfenol A och ersättning bisfenol S inducerad för tidig hypothalamic neurogenesis i embryonal zebrafisk27. Dessutom optimerade vissa forskare protokollet för att utföra motsvarande studier. En nyligen genomförd studie eliminerade toxiciteten av amyloid beta (Aβ) i en enkel, hög genomströmning zebrafisk modell med kaseinbelagda guld nanopartiklar (βCas AuNPs). Det visade att βCas AuNPs i systemisk cirkulation flyttade över blod – hjärnbarriären av zebrafisk larver och beslagtagna intracerebrala Aβ42, framkalla toxicitet på ett ospecifikt, förkläde-liknande sätt, som stöddes av beteendemässiga patologi28.
Förflyttning, banvinkel och social aktivitet är tre neurobeteendeindikatorer som används för att studera neurotoxicitetseffekterna av zebrafisklarver efter exponering för föroreningar i det presenterade protokollet. Locomotion mäts av larvernas badavstånd och kan skadas efter exponering för föroreningar. Banvinkel och social aktivitet är närmare besläktade med hjärnans funktion och centrala nervsystemet29. Banvinkeln avser vinkeln på djurrörelsernas bana i förhållande tillsimriktningen 30. Åtta vinkelklasser från ~-180°-~+180° är inställda i systemet. För att förenkla jämförelsen definieras sex klasser i slutresultatet som rutinsvängar (-10° ~0°, 0° ~+10°), genomsnittliga varv (-10° ~-90°, +10° ~+90°) och responsiva svängar (-180° ~-90°, +90° ~+180°) enligt våra tidigare studier21,22. Tvåfiskars social aktivitet är grundläggande för grupps shoaling beteende; här definieras ett distansera av < 0.5 cm mellan två larver som är giltiga som social kontakt.
Protokollet presenteras här visar en tydlig process för att studera neurobehavioral effekter på zebrafisk larver och ger ett sätt att avslöja neurotoxicitet effekterna av olika ämnen eller föroreningar. Protokollet kommer att gynna forskare som är intresserade av att studera neurotoxicitet av miljöföroreningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta arbete ger ett detaljerat experimentellt protokoll för att utvärdera neurotoxiciteten hos miljöföroreningar med zebrafisklarver. Zebrafisk går igenom processen från embryon till larver under exponeringsperioden, vilket innebär att god vård av embryon och larver är viktigt. Allt som påverkar utvecklingen av embryon och larver kan påverka slutresultatet. Här diskuteras kulturmiljön, exponeringsprocessen och experimentella förhållanden för att säkerställa att hela analysen blir framgångsrik.
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma för det ekonomiska stödet från National Natural Science Foundation of China (21876135 och 21876136), Kinas nationella stora vetenskaps- och teknikprojekt (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), stiftelsen för MOE-Shanghai Key Laboratory of Children’s Environmental Health (CEH201807-5) och Vetenskapsrådet (nr 639-2013-6913).
Materials
| 48-well-microplate | Corning | 3548 | Embyros housing |
| 6-well-microplate | Corning | 3471 | Embyros housing |
| BDE-47 | AccuStandard | 5436-43-1 | Pollutant |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Cosolvent |
| Microscope | Olympus | SZX 16 | Observation instrument |
| Pipette | Eppendorf | 3120000267 | Transfer solution |
| Zebrabox | Viewpoint | ZebraBox | Behavior instrument |
| Zebrafish | Shanghai FishBio Co., Ltd. | Tubingen | Zebrafish supplier |
| ZebraLab | Viewpoint | ZebraLab | Behavior software |
References
- Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
- Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
- Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
- Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
- Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. . Environmental Organic Chemistry. , (2016).
- Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
- Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
- Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
- Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
- Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
- Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
- Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
- Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
- Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
- Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
- Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
- Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
- Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
- Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
- Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
- Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
- Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
- Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
- Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
- Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
- Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos?. Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
- Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
- Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
- Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
- Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. . Drug Safety Evaluation. , 271-279 (2011).
- Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
- Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
- Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
- Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
- Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).
