सजातीय ग्लाइकोकोन्जुगेट संयुक्त अप्राकृतिक अमीनो एसिड निगमन और वैक्सीन प्रयोजनों के लिए क्लिक-रसायन विज्ञान द्वारा उत्पादित
Summary
आनुवंशिक कोड विस्तार एक परिभाषित साइट पर एक वाहक प्रोटीन पर एक biorthogonal कार्यात्मक समूह असर एक अप्राकृतिक अमीनो एसिड की शुरूआत के लिए लागू किया जाता है । द्वितोथोगोनल फ़ंक्शन का उपयोग एक सजातीय ग्लाइकोकोंजुगेट वैक्सीन प्रदान करने के लिए कार्बोहाइड्रेट एंटीजन की साइट-चयनात्मक युग्मन के लिए किया जाता है।
Abstract
आनुवंशिक कोड विस्तार अपनी विशेषताओं को संशोधित करने, नए प्रोटीन कार्यों का अध्ययन करने या बनाने या प्रोटीन conjugates तक पहुंच रखने के लिए प्रोटीन में अप्राकृतिक अमीनो एसिड (यूएए) पेश करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। बंद करो codon दमन, विशेष रूप से एंबर codon दमन, परिभाषित पदों पर आनुवंशिक रूप से UAAs परिचय के लिए सबसे लोकप्रिय विधि के रूप में उभरा है । यह पद्धति यहां एक वाहक प्रोटीन की तैयारी के लिए लागू होती है जिसमें एक बायोऑर्थोगोनल कार्यात्मक समूह को शरण देने वाला यूएए होता है। इस प्रतिक्रियाशील हैंडल का उपयोग एक सजातीय ग्लाइकोकोंज्जगेट वैक्सीन प्रदान करने के लिए सिंथेटिक ओलिगोसैकराइड हैप्टन को विशेष रूप से और कुशलता से भ्रष्टाचार करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल 1:1 कार्बोहाइड्रेट हैप्टन/वाहक प्रोटीन अनुपात में ग्लायकोकोंजगेट्स के संश्लेषण तक सीमित है, लेकिन द्वितोथोगोनल कार्यात्मक समूहों के कई जोड़े के लिए उत्तरदायी है। ग्लाइकोकोकोंजुगेट वैक्सीन एकरूपता पूर्ण भौतिक-रासायनिक लक्षण वर्णन सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कसौटी है, जिससे अधिक से अधिक मांग करने वाली दवा नियामक एजेंसी की सिफारिशों को संतोषजनक बनाया जा सके, एक ऐसा मापदंड जो शास्त्रीय संयोजण रणनीतियों से अपूर्ण है । इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल वास्तविक संयोजित वैक्सीन की संरचना को बारीकी से ट्यून करना संभव बनाता है, जिससे संरचना-इम्यूनोजेनिसिटी संबंधों को संबोधित करने के लिए उपकरणों को जन्म देता है।
Introduction
ग्लाइकोकोंजुगेट टीके संक्रामक रोगों के रोगनिरोधी उपचार के लिए उपलब्ध वैक्सीन शस्त्रागार के आवश्यक तत्व हैं। वे युवा शिशुओं सहित एक व्यापक आयु वर्ग में सुरक्षित, अच्छी तरह से सहन और कुशल हैं । वे मेनिंगोकोकस, न्यूमोकोकस या हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा टाइप बी1जैसे कैप्सुलेटेड बैक्टीरिया के कारण होने वाले संक्रमणों के खिलाफ इष्टतम रक्षा प्रदान करते हैं। ग्लाइकोकोकोंज्जुगेट टीके शुद्ध बैक्टीरियल पॉलीसैकराइड्स से बने होते हैं जो बैक्टीरिया या सिंथेटिक ओलिगोसैकराइड्स के कैप्सूल बनाते हैं जो इन सतह-व्यक्त पॉलीसैकराइड्स2की नकल करते हैं, जो सहसंयोजक रूप से वाहक प्रोटीन से जुड़े होते हैं। कार्बोहाइड्रेट एंटीजन3द्वारा व्यक्त किए गए एंटीजेनिक निर्धारक के खिलाफ निर्देशित सुरक्षात्मक विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए वाहक प्रोटीन की उपस्थिति आवश्यक है। कार्बोहाइड्रेट एंटीजन के सावधानीपूर्वक चयन और उत्पादन के अलावा, ग्लाइकोकोंजुगेट वैक्सीन की प्रभावकारिता पर प्रभाव डालने के लिए जानी जाने वाली विशेषताएं हैं: वाहक प्रोटीन की प्रकृति, संजूगेशन रसायन (यदि उपयोग किया जाता है तो लिंकर की प्रकृति और लंबाई सहित), या सैकराइड/प्रोटीन अनुपात3। जाहिर है, जिन स्थितियों पर सैकराइड को प्रोटीन के साथ-साथ कनेक्टिविटी पॉइंट्स की संख्या इम्यूनोजेनिसिटी के लिए प्रासंगिक है । आज तक, इन दोनों मापदंडों का शायद ही अध्ययन किया गया हो क्योंकि ग्लायकोकोन्जगेट्स की तैयारी काफी हद तक अनुभवजन्य बनी हुई है। उनका संश्लेषण आमतौर पर वाहक प्रोटीन अनुक्रम पर मौजूद लाइसाइन या एस्पार्टिक/एस्पार्टिक एसिड साइड-चेन अवशेषों के क्रमशः माइन या कार्बोक्सिलिक एसिड कार्यों के उपयोग पर निर्भर करता है। यह एक एकल नहीं बल्कि ग्लायकोकोन्जुगेट्स के विषम मिश्रण की ओर जाता है।
प्रोटीन में अमीनो एसिड अवशेषों की प्रतिक्रियाशीलता, पहुंच या वितरण पर बजाना अधिक परिभाषित ग्लाइस्कोकोंजगेट्स को जन्म देता है जो सैकराइड/प्रोटीन कनेक्टिविटी4के प्रभाव को दस्तावेज करने के लिए अधिक विश्वसनीय हैं। इस लक्ष्य की दिशा में एक कदम आगे प्रोटीन ग्लाइकन कपलिंग तकनीक लागू करके प्राप्त किया जा सकता है, एक पुनः संयोजन प्रक्रिया जो कोशिका कारखानों5,6में नियंत्रित ग्लाइकोकोंज्जगेट टीकों के उत्पादन की अनुमति देती है। हालांकि, ग्लाइकोसिलेशन विशेष रूप से डी/EXNYS/T sequons के भीतर एक शतावरी अवशेषों पर होता है (जिससे एक्स 20 प्राकृतिक अमीनो एसिड से बाहर है), वाहक प्रोटीन पर स्वाभाविक रूप से मौजूद नहीं है ।
साइट चयनात्मक म्यूटेनेसिस और विशेष रूप से उनकी अत्यधिक और चयनात्मक प्रतिक्रियाशीलता का दोहन करने के लिए साइस्टीन का समावेश एक वैकल्पिक7,8के रूप में दिखाई देता है । वाहक प्रोटीन का उत्पादन उनके अनुक्रम में यूएए को शामिल करने से सजातीय ग्लाइकोकोजूगेट वैक्सीन तैयार करने के लिए और भी लचीलापन मिल सकता है । 100 से अधिक यूएए विकसित किए गए हैं और इसके अलावा विभिन्न प्रोटीन9,10में शामिल किए गए हैं । उनमें से कई में बायोऑर्थोगोनल कार्य होते हैं जो आमतौर पर पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधनों को पूरा करने के लिए उपयोग किए जाते हैं11 या बायोफिजिकल जांच12 या दवाओं13 को भ्रष्टाचार करने के लिए लेकिन जो कार्बोहाइड्रेट एंटीजन के साथ आगे के संवर्जन के लिए आदर्श हैंडल हैं। बायोटेक14 द्वारा सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण15 का उपयोग करके सफल उदाहरणों का दावा किया गया है लेकिन इस रणनीति के अनुसार ग्लायकोकोन्जुगेट टीकों की तैयारी अभी भी लोकप्रिय होने का इंतजार कर रही है।
उत्परिवर्तित वाहक प्रोटीन के उत्पादन के लिए वीवो रणनीति में आवेदन के लिए एक संशोधित ट्रांसलेशनल मशीनरी की आवश्यकता होती है जिसमें एक विशिष्ट कोडन, कोडन को पहचानने वाला एक ट्रान और एक अमीनोसिल-ट्रान संश्लेषण (एएआरएस) शामिल है जो विशेष रूप से टीएनए(चित्रा 1)16पर यूएए के हस्तांतरण को उत्प्रेरित करता है। पाइरोलिसिन एम्बर स्टॉप कोडन दमन यूएए को शामिल करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक है, विशेष रूप से प्रोपार्गिल-लिसाइन (पीआरके)17। उत्तरार्द्ध पूरी तरह से परिभाषित, सजातीय ग्लाइकोकोजगेट्स प्रदान करने के लिए एजिडो-कार्यात्मक कार्बोहाइड्रेट हैप्टेंस के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है। वर्तमान पांडुलिपि में हम वर्णन करते हैं कि प्रोपआर्जिल-एल-लिसाइन को कैसे संश्लेषित किया जाए, एक यूएए एक एल्केन हैंडल ले जाता है, बैक्टीरिया में अपने अनुवाद के दौरान इसे एक लक्षित प्रोटीन में कैसे शामिल किया जाए और अंत में संशोधित प्रोटीन और क्लिक रसायन शास्त्र का उपयोग करके एक एजाइड फ़ंक्शन ले जाने वाले एक हैप्टन के बीच कैसे संवस्तन किया जाए।
Protocol
Representative Results
Discussion
साइट निर्देशित म्यूटेनेसिस प्रोटीन की एक परिभाषित स्थिति पर विशिष्ट अमीनो एसिड को शामिल करने की एक सीधी रणनीति है जो ग्लाइस्कोकोंजुगेटटीके7, 8, 14तैयार करने के उद्देश्य से बमुश्किल उप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ई.C कृतज्ञता ला रेगियन पेज़ डे ला लॉयर (परी Scientifique कार्यक्रम “BioSynProt”), विशेष रूप से टीवी के लिए एक डॉक्टरेट फैलोशिप से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । हम डॉ रॉबर्ट बी क्वास्ट (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, टूलूज़, फ्रांस) को भी अपनी बहुमूल्य तकनीकी सलाहों के लिए स्वीकार करते हैं।
Materials
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
References
- Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
- Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
- Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
- Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
- Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
- Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
- Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
- Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
- Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
- Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment – Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
- Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging–Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
- Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
- . Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS) (2018)
- Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
- Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
- Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
- . Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019)
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
- Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
- Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
- Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
- Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
- Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
- Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
- Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
- Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).
