Glicoconjugate homogêneo produzido por incorporação combinada de aminoácidos não naturais e click-química para fins de vacina

Summary

A expansão do código genético é aplicada para a introdução de um aminoácido não natural com um grupo funcional biorthogonal em uma proteína portadora em um local definido. A função biorthogonal é ainda utilizada para o acoplamento seletivo local de um antígeno de carboidratos para fornecer uma vacina glicoconjugar homogênea.

Abstract

A expansão do código genético é uma ferramenta poderosa para introduzir aminoácidos não naturais (UAAs) em proteínas para modificar suas características, estudar ou criar novas funções proteicas ou ter acesso a conjugados proteicos. A supressão do códon stop, em particular a supressão do codon âmbar, emergiu como o método mais popular para introduzir geneticamente UAAs em posições definidas. Esta metodologia está aqui aplicada à preparação de uma proteína portadora contendo um UAA abrigando um grupo funcional bioortogonal. Esta alça reativa pode ser usada em seguida para enxertar especificamente e eficientemente um oligossacarídeo sintético hapten para fornecer uma vacina glicoconjugate homogênea. O protocolo limita-se à síntese de glicoconjugados em uma relação de proteína de 1:1 carboidratos hapten/portador, mas ameniz a numerosos pares de grupos funcionais biorthogonais. A homogeneidade da vacina Glicococonjugate é um critério importante para garantir a caracterização física-química completa, satisfazendo, assim, as recomendações cada vez mais exigentes da agência reguladora de medicamentos, critério não atendido pelas estratégias clássicas de conjugação. Além disso, este protocolo permite afinar finamente a estrutura da vacina conjugada real, dando origem a ferramentas para lidar com as relações estrutura-imunogenicidade.

Introduction

As vacinas glicoconjugate são elementos essenciais do arsenal vacinal disponível para o tratamento profilático de doenças infecciosas. Eles são seguros, bem tolerados e eficientes em uma faixa etária ampla, incluindo bebês jovens. Eles fornecem a defesa ideal contra infecções causadas por bactérias capsuladas como meningococcus, pneumococcus ou Haemophilus influenzae tipo b¹. As vacinas glicococonjugate são feitas de polissacarídeos bacterianos purificados que formam as cápsulas de bactérias ou oligossacarídeos sintéticos que imitam esses polissacarídeos expressos na superfície^2,que estão covalentemente ligados a uma proteína portadora. A presença de uma proteína portadora é essencial para promover respostas imunes humorais protetoras dirigidas contra o determinante antigênico expresso pelos antígenos de carboidratos³. Além de uma cuidadosa seleção e produção do antígeno de carboidratos, as características conhecidas por exercer influência sobre a eficácia de uma vacina glicoconjugate são: a natureza da proteína portadora, a química de conjugação (incluindo a natureza e o comprimento da ligação, se utilizada), ou a razão sacarídeo/proteína³. Obviamente, as posições em que o sacarídeo é conjugado à proteína, bem como o número de pontos de conectividade são relevantes para a imunogenicidade. Até o momento, esses dois parâmetros dificilmente foram estudados porque a preparação dos glicoconjugados permanece em grande parte empírica. Sua síntese geralmente se baseia no uso de funções de ácido ami ou carboxílico de, respectivamente, resíduos de lise ou ácido aspartic/glutamico presentes na sequência proteica portadora. Isso não leva a uma única, mas a uma mistura heterogênea de glicoconjugados.

Brincar com a reatividade, acessibilidade ou distribuição dos resíduos de aminoácidos na proteína dá origem a glicoconjugados mais definidos que são mais confiáveis para documentar o efeito da conectividade sacarídeo/proteína⁴. Um avanço nesse sentido pode ser alcançado com a aplicação da tecnologia de acoplamento de proteínas glican, um processo recombinante que permite a produção de vacinas gentificas de glicoconjugate nas fábricas de células^5,6. No entanto, a glicosylação ocorre exclusivamente em um resíduo de asparagine dentro de sequons D/EXNYS/T (pelo qual X é qualquer um dos 20 aminoácidos naturais), não naturalmente presente nas proteínas portadoras.

Mutagênese seletiva do local e, em particular, incorporação de cisteínas para explorar sua reatividade altamente e seletiva aparece como uma alternativa^7,8. A produção de proteínas portadoras que incorporam UAAs em sua sequência pode oferecer ainda mais flexibilidade para a preparação homogênea da vacina glicoconjugate. Mais de 100 UAAs foram desenvolvidos e incorporados em várias proteínas^9,10. Muitos deles contêm funções bioortogonais geralmente usadas para realizar modificações pós-translacionais¹¹ ou para enxertar sondas biofísicas¹² ou drogas^13, mas que são alças ideais para posterior conjugação com antígenos de carboidratos. Exemplos bem-sucedidos foram reivindicados pela Biotech¹⁴ usando a síntese de proteínas livres de células^15, mas a preparação de vacinas de glicoconjugate de acordo com essa estratégia ainda espera se popularizar.

A aplicação da estratégia in vivo para a produção de proteína transportadora mutada precisa de uma máquina translacional modificada que inclua um códon específico, um tRNA reconhecendo o códon e uma sithetase aminoacyl-tRNA (aaRS) que catalisa especificamente a transferência do UAA no tRNA (Figura 1)¹⁶. A supressão do codon de parada âmbar pirrolise é um dos métodos mais utilizados para incorporar UAA, em particular a propargyl-lysine (PrK)¹⁷. Este último, por sua vez, pode reagir com haptens de carboidratos azido-funcionalizados para fornecer glicococonjugados totalmente definidos e homogêneos. No presente manuscrito descrevemos como sintetizar a propargyl-L-lysine, uma UAA carregando uma alça de alkyne, como incorporá-la em uma proteína alvo durante sua tradução em uma bactéria e, finalmente, como realizar a conjugação entre a proteína modificada e um hapten carregando uma função de azida usando a química do clique.

Protocol

1. Síntese do UAA: propargyl-lysine (PrK) Síntese de Nα-Boc-propargyl-lysine18 Dissolva 500 mg de Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) em uma mistura de aquoso 1 M NaOH (5 mL) e THF (5 mL) em um frasco e encaixe o frasco com um septo de silício. Esfrie o frasco em um banho de gelo e adicione 158 μL de clorofórmio propargyl (1,62 mmol) dropwise (durante um período de 2-3 minutos) usando uma microsinga durante a agitação. Aqueça a mistura de …

Representative Results

Neste projeto, foi preparada uma vacina glicoconjugate homogênea utilizando-se a estratégia de supressão do códon de parada âmbar para introduzir um UAA em local definido(Figura 1). A adesivo de superfície pneumoccocal A foi selecionada como a moiety proteção portadora. Esta proteína é altamente conservada e expressa por todas as cepas de Streptococcus pneumoniae22. É altamente imunogênico e previamente utilizado c…

Discussion

Mutagênese dirigida ao local é uma estratégia simples para incorporar aminoácidos específicos em uma posição definida de uma proteína que permanece mal utilizada com o objetivo de preparar vacinas glicoconjugar^7,8,14. Mutagênese clássica baseada na abordagem de 20 aminoácidos naturais é altamente eficiente, uma vez que nenhuma modificação da máquina de tradução é necessária. Mutações de cisteína geralmente …

Materials

AIM (autoinductif medium)	Formedium	AIMLB0210	Solid powder
Boc-Lys-OH	Alfa-Aesar	H63859	Solid powder
BL21(DE3)	Merck Novagen	69450	E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin	Machery Nagel	Protino	Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH	this study		same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT	this study		pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid	gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)		plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate	Sigma-Aldrich	460923	Liquid
Sonicator	Thermo Fisher	FB120-220