متجانسة جليكوكونجوجيت التي تنتجها الجمع بين دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية وكليك الكيمياء لأغراض لقاح
Summary
يتم تطبيق التوسع في الشفرة الوراثية لإدخال حمض أميني غير طبيعي يحمل مجموعة وظيفية بيولوجيا على بروتين حامل في موقع محدد. كما تستخدم وظيفة بيولوجياً في اقتران انتقائي للموقع من مستضد الكربوهيدرات لتوفير لقاح جليكوكونجوجيت متجانس.
Abstract
التوسع في الشفرة الوراثية هو أداة قوية لإدخال الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAAs) في البروتينات لتعديل خصائصها، لدراسة أو إنشاء وظائف بروتينية جديدة أو الحصول على البروتين المتقارن. وقد برز وقف قمع كودون، ولا سيما قمع كودون العنبر، باعتبارها الطريقة الأكثر شعبية لإدخال UAAs وراثيا في المواقف المحددة. هذه المنهجية هي التي تطبق هنا لإعداد بروتين الناقل يحتوي على UAA إيواء مجموعة وظيفية bioorthogonal. ويمكن استخدام هذا المقبض التفاعلي بعد ذلك على وجه التحديد وكفاءة الكسب غير المشروع هابتين أوليغوساشاريد الاصطناعية لتوفير لقاح جليكوكونجيت متجانس. يقتصر البروتوكول على تخليق الجليكوكونجوتات في نسبة البروتين 1:1 الكربوهيدرات هابنت / الناقل ولكن قابلة لأزواج عديدة من المجموعات الوظيفية biorthogonal. التجانس لقاح الجليكوكونجوجيت هو معيار مهم لضمان توصيف كامل الفيزيائية الكيميائية، وبالتالي، تلبية أكثر وأكثر تطلبا توصيات وكالة تنظيم الأدوية، وهو المعيار الذي لا يتم تلبيتها من قبل استراتيجيات الاقتران الكلاسيكية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول يجعل من الممكن ضبط بنية اللقاح المترافق الفعلي بدقة، مما يؤدي إلى إنشاء أدوات لمعالجة العلاقات بين البنية والمناعة.
Introduction
وتشكل اللقاحات الجِليكونية عناصر أساسية في ترسانة اللقاحات المتاحة للمعالجة الوقائية للأمراض المعدية. فهي آمنة وجيدة التحمل وفعالة في فئة عمرية واسعة بما في ذلك الرضع الصغار. أنها توفر الدفاع الأمثل ضد العدوى الناجمة عن البكتيريا المنقلبة مثل المكورات السحائية، المكورات الرئوية أو الهيموفلوس الأنفلونزا نوع ب1. مصنوعة لقاحات جليكوكوكونجوجيت من السكريات البكتيرية النقية التي تشكل كبسولات من البكتيريا أو oligosaccharides الاصطناعية التي تحاكي هذه السكريات عبر السطح2، والتي ترتبط بقوة إلى البروتين الناقل. وجود بروتين الناقل أمر ضروري لتعزيز الاستجابات المناعية الحماية الموجهة ضد المحددات المضادة للحساسية التي أعرب عنها المستضدات الكربوهيدرات3. وبصرف النظر عن اختيار دقيق وإنتاج مستضد الكربوهيدرات، والميزات المعروفة لممارسة تأثير على فعالية لقاح جليكوكونجوت هي: طبيعة البروتين الناقل، والكيمياء الاقتران (بما في ذلك طبيعة وطول الرابط إذا استخدمت)، أو نسبة saccharide /البروتين3. ومن الواضح أن المواقف التي يتم فيها مترافق sacchargated إلى البروتين، فضلا عن عدد نقاط الاتصال ذات الصلة المناعية. حتى الآن، لم يتم دراسة هذين المعلمين لأن إعداد جليكوكونكونجات لا يزال تجريبيا إلى حد كبير. توليفها يعتمد عادة على استخدام وظائف أمين أو حمض الكربوكسيلي من, على التوالي, ليسين أو الأسبارتيك / حمض بقايا جانبية سلسلة موجودة على تسلسل البروتين الناقل. وهذا لا يؤدي إلى واحد ولكن إلى خليط غير متجانس من الجليكوكونجات.
اللعب على التفاعل، وإمكانية الوصول أو توزيع بقايا الأحماض الأمينية في البروتين يؤدي إلى زيادة تعريف glycoconjugates التي هي أكثر موثوقية لتوثيق تأثير اتصال سكريميد / البروتين4. ويمكن تحقيق خطوة إلى الأمام نحو هذا الهدف من خلال تطبيق البروتين glycan التكنولوجيا اقتران ، وهي عملية المؤتلفة التي تسمح لإنتاج لقاحات الجليكوكونجات الخاضعة للرقابة في مصانع الخلايا5،6. ومع ذلك، فإن جليكوسيليشن تجري حصرا في بقايا الهليون داخل D/EXNYS/T sequons (حيث X هو أي من أصل 20 الأحماض الأمينية الطبيعية)، وليس بشكل طبيعي على البروتينات الناقل.
يبدو أن الطفرات الانتقائية للموقع ولا سيما دمج السيشتاينات لاستغلال تفاعلها الشديد والانتقائي هو بديل7،8. ويمكن أن يوفر إنتاج البروتينات الحاملة التي تدمج UAAs في تسلسلها مرونة أكبر لإعداد لقاح جليكوكونجيت متجانس. وقد تم تطوير أكثر من 100 UAAs وأدرجت في مزيد من البروتينات المختلفة9،10. كثير منهم تحتوي على وظائف بيورثوغونال تستخدم عادة لتنفيذ التعديلات ما بعد الترجمة11 أو لالكسب غير المشروع تحقيقات الفيزياء الحيوية12 أو الأدوية13 ولكن التي هي مقابض مثالية لمزيد من الاقتران مع مستضدات الكربوهيدرات. وقد ادعى أمثلة ناجحة من قبل Biotech14 باستخدام تخليد البروتين خالية من الخلايا15 ولكن إعداد لقاحات جليكوكونجوجيت وفقا لهذه الاستراتيجية لا يزال ينتظر لتصبح شعبية.
تطبيق استراتيجية في الجسم الحي لإنتاج البروتين الناقل تحور يحتاج إلى تعديل الآلات التي تتضمن كودون محددة، وهرنا الاعتراف كودون و aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) التي تحفز على وجه التحديد نقل UAA على tRNA (الشكل 1)16. و pyrrolysine العنبر وقف قمع كودون هي واحدة من الأساليب الأكثر استخداما لدمج UAA، ولا سيما propargyl-lysine (PrK)17. يمكن أن تتفاعل هذه الأخيرة بدورها مع الهيمات الكربوهيدرات azido وظيفية لتوفير تعريف كامل, متجانسة الجليسكوكونكونجات. في هذه المخطوطة، نُصف كيفية توليف البرارججيل-إل-ليسين، وهو عبارة عن 1 UAA يحمل مقبض ألكين، وكيفية دمجه في البروتين المستهدف أثناء ترجمته في بكتيريا، وأخيراً كيفية إجراء الاقتران بين البروتين المعدل والهابتين الذي يحمل وظيفة أزيدية باستخدام كيمياء النقر.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن الطفرات الموجهة للموقع هي استراتيجية مباشرة لدمج أحماض أمينية محددة في موضع محدد للبروتين الذي لا يزال بالكاد يستخدم بهدف إعداد لقاحات جليكوكونجوجيت7،8،14. الطفرات الكلاسيكية على أساس نهج 20 الأحماض الأمينية الطبيعية كفاءة عالية منذ ل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.C. يعرب عن امتنانه للدعم المالي المقدم من La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program “BioSynProt”)، ولا سيما زمالة الدكتوراه في برنامج T.V. كما نُقرّ الدكتور روبرت ب. كواست (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, تولوز, فرنسا) لنصائحه الفنية الثمينة.
Materials
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
References
- Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
- Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
- Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
- Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
- Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
- Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
- Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
- Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
- Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
- Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment – Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
- Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging–Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
- Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
- . Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS) (2018)
- Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
- Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
- Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
- . Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019)
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
- Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
- Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
- Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
- Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
- Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
- Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
- Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
- Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).
