Homogen glycoconjugate produceret af kombineret unaturlig aminosyre inkorporering og klikkemi til vaccineformål

Summary

Genetisk kode ekspansion anvendes til indførelse af en unaturlig aminosyre forsynet med en biorthogonal funktionel gruppe på et bæreprotein på et defineret sted. Den biorthogonale funktion anvendes yderligere til den stedselektive kobling af et kulhydratantigen for at give en homogen glykokonjugavaccine.

Abstract

Genetisk kode ekspansion er et kraftfuldt værktøj til at indføre unaturlige aminosyrer (UAAs) i proteiner til at ændre deres egenskaber, til at studere eller skabe nye protein funktioner eller at få adgang til protein konjugater. Stop codon undertrykkelse, især rav codon undertrykkelse, har vist sig som den mest populære metode til genetisk indføre UAAs på definerede positioner. Denne metode anvendes heri til fremstilling af et bærerprotein, der indeholder et ULA, der huser en bioorthogonal funktionel gruppe. Dette reaktive håndtag kan derefter bruges til specifikt og effektivt at pode en syntetisk oligosaccharid hapten at give en homogen glycoconjuga vaccine. Protokollen er begrænset til syntesen af glycoconjugates i en 1:1 kulhydrat hapten / luftfartsselskab protein forhold, men modtagelig for mange par biorthogonal funktionelle grupper. Glycoconjugate vaccine homogenitet er et vigtigt kriterium for at sikre fuldstændig fysisk-kemisk karakterisering, og dermed opfylder flere og mere krævende narkotika regulering agentur anbefalinger, et kriterium, som er uopfyldt af klassiske bøjning strategier. Desuden gør denne protokol det muligt at finjustere strukturen af den faktiske konjugatvaccine, hvilket giver anledning til værktøjer til at løse struktur-immunogenicitet relationer.

Introduction

Glycoconjuga vacciner er væsentlige elementer i vaccinen arsenal til rådighed for profylaktisk behandling af smitsomme sygdomme. De er sikre, veltolererede og effektive i en bred aldersgruppe, herunder små børn. De giver det optimale forsvar mod infektioner forårsaget af kapsulerede bakterier som meningococcus, pneumokokker eller Haemophilus influenzae type b¹. Glycoconjuga vacciner er lavet af renset bakterielle polysaccharider, der danner kapsler af bakterier eller syntetiske oligosaccharider, der efterligner disse overflade-udtrykt polysaccharider², som er kovalent knyttet til et luftfartsselskab protein. Tilstedeværelsen af et bærerprotein er afgørende for at fremme beskyttende humoral immunrespons rettet mod den antigene determinant udtrykt af kulhydratantigener³. Bortset fra en omhyggelig udvælgelse og produktion af kulhydratantigenet er de funktioner, der vides at påvirke effekten af en glycoconjuga-vaccine: luftfartsselskabets proteins art, bøjningskemien (herunder linkerens art og længde, hvis den anvendes), eller saccharid/proteinforhold³. Det er klart, at de positioner, hvor saccharid er konjugeret til proteinet samt antallet af forbindelsespunkter, er relevante for immunogenicitet. Til dato er disse to parametre næppe blevet undersøgt, fordi præparatet af glykokonjugates stadig i vid udstrækning er empirisk. Deres syntese normalt er afhængig af brugen af amin eller carboxylsyre funktioner af henholdsvis lysin eller aspartic / glutaminsyre sidekæde rester til stede på luftfartsselskabet protein sekvens. Dette fører ikke til en enkelt, men til en heterogen blanding af glycoconjugates.

Afspilning på reaktivitet, tilgængelighed eller fordeling af aminosyrerester i proteinet giver anledning til mere definerede glycoconjugates, der er mere pålidelige til at dokumentere effekten af saccharid/proteinforbindelse⁴. Et skridt fremad mod dette mål kan opnås ved at anvende protein glycan kobling teknologi, en rekombinant proces, der gør det muligt at producere kontrollerede glycoconjuga vacciner i celle fabrikker^5,6. Glycosylationen finder dog udelukkende sted ved en asparagin rest i D/EXNYS/T sequons (hvor X er en ud af de 20 naturlige aminosyrer), ikke naturligt forekommer på bæreproteinerne.

Selektiv mutagenese på stedet og navnlig inkorporering af cystein for at udnytte deres stærkt og selektive reaktivitet fremstår som et alternativ^7,8. Produktion af bæreproteiner, der inkorporerer UAA’er i deres rækkefølge, kan give endnu mere fleksibilitet til homogent glykokonjugatvaccinepræparat. Der er udviklet og inkorporeret mere end 100 AUA’er i forskellige proteiner^9,10. Mange af dem indeholder bioorthogonale funktioner, der normalt anvendes til at udføre post translationelle^{modifikationer 11} eller til at pode biofysiske^{sonder 12} eller narkotika^13, men som er ideelle håndtag til yderligere bøjning med kulhydratantigener. Vellykkede eksempler er blevet hævdet af Biotech¹⁴ ved hjælp af celle-fri proteinsyntese^15, men forberedelse af glycoconjuga vacciner i henhold til denne strategi stadig venter på at blive populariseret.

Anvendelse af in vivo-strategien for produktion af muteret bæreprotein kræver en modificeret translationel maskine, der omfatter en specifik codon, et tRNA, der anerkender codon og en aminoacyl-tRNA-syntetase (aaRS), som specifikt katalyser overførsel af ULA på tRNA (Figur 1)¹⁶. Den pyrrolysin rav stop codon undertrykkelse er en af de mest udbredte metoder til at indarbejde ULA, især propargyl-lysin (PrK)¹⁷. Sidstnævnte kan til gengæld reagere med azido-funktionaliserede kulhydrat haptens at give fuldt definerede, homogene glycoconjugates. I det foreliggende manuskript beskriver vi, hvordan vi syntetiserer propargyl-L-lysin, en UAA med et alkynehåndtag, hvordan det indarbejdes i et målprotein under oversættelsen i en bakterie, og endelig hvordan man udfører bøjning mellem det modificerede protein og en hapten, der bærer en azide-funktion ved hjælp af klikkemi.

Protocol

1. Syntese af ULA: propargyl-lysin (PrK) Syntese afN α-Boc-propargyl-lysin18 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) opløses i en blanding af vandige 1 M NaOH (5 ml) og THF (5 ml) i en kolbe og monteres kolben med et siliciumskvæg. Kolben afkøles i et isbad, og der tilsættes derefter 158 μL propargylchloroformat (1,62 mmol) dråbevis (over en periode på 2-3 minutter) ved hjælp af en mikrosyring under omrøring. Reaktionsblandingen opvarme…

Representative Results

I dette projekt blev der fremstillet en homogen glykokonjugavaccine ved hjælp af den gule codon-undertrykkelsesstrategi for at indføre en ULA på et defineret sted (figur 1). Pneumoccocal overflade adhæsin A blev valgt som bærer protein moiety. Dette protein er stærkt bevaret og udtrykt af alle stammer af Streptococcus pneumoniae22. Det er meget immunogent og tidligere anvendt som bærer i pneumokokvaccineformuleringer<su…

Discussion

Site-rettet mutagenesis er en enkel strategi for at indarbejde specifikke aminosyrer på en defineret position af et protein, som stadig næppe anvendes med det formål at forberede glycoconjuga vacciner^7,8,14. Klassisk mutagenese baseret på 20 naturlige aminosyrer tilgang er yderst effektiv, da ingen ændring af oversættelsen maskiner er påkrævet. Cysteine mutationer er normalt målrettet til yderligere at udforske den unik…

Materials

AIM (autoinductif medium)	Formedium	AIMLB0210	Solid powder
Boc-Lys-OH	Alfa-Aesar	H63859	Solid powder
BL21(DE3)	Merck Novagen	69450	E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin	Machery Nagel	Protino	Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH	this study		same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT	this study		pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid	gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)		plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate	Sigma-Aldrich	460923	Liquid
Sonicator	Thermo Fisher	FB120-220