Glycoconjugate homogène produit par combined unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glycoconjugate Produit par Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glycoconjugate Produit par Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glyc
Summary
L’expansion du code génétique est appliquée pour l’introduction d’un acide aminé contre nature portant un groupe fonctionnel biorthogonal sur une protéine porteuse à un site défini. La fonction biorthogonale est également utilisée pour le couplage sélectif d’un antigène carbohydrate pour fournir un vaccin glycoconjugate homogène.
Abstract
L’expansion du code génétique est un outil puissant pour introduire des acides aminés contre nature (UUA) dans les protéines afin de modifier leurs caractéristiques, d’étudier ou de créer de nouvelles fonctions protéiques ou d’avoir accès à des conjugués protéiques. Arrêter la suppression du codon, en particulier la suppression du codon ambré, est apparue comme la méthode la plus populaire pour introduire génétiquement des AUA à des positions définies. Cette méthodologie est appliquée à la préparation d’une protéine porteuse contenant un UAA hébergeant un groupe fonctionnel bioorthogonal. Cette poignée réactive peut ensuite être utilisée pour greffer spécifiquement et efficacement un hapten oligosaccharide synthétique pour fournir un vaccin glycoconjugate homogène. Le protocole est limité à la synthèse des glycoconjugates dans un rapport 1:1 de protéine de hydrate de carbone/porteur mais favorable à de nombreuses paires de groupes fonctionnels biorthogonal. L’homogénéité vaccinale du glycococonjugate est un critère important pour assurer une caractérisation physico-chimique complète, satisfaisant ainsi des recommandations de plus en plus exigeantes des organismes de réglementation des médicaments, un critère qui n’est pas satisfait par les stratégies classiques de conjugaison. En outre, ce protocole permet d’affiner finement la structure du vaccin conjugué réel, donnant lieu à des outils pour traiter les relations structure-immunogénicité.
Introduction
Les vaccins glycoconjugates sont des éléments essentiels de l’arsenal vaccinal disponible pour le traitement prophylactique des maladies infectieuses. Ils sont sûrs, bien tolérés et efficaces dans un large groupe d’âge, y compris les jeunes nourrissons. Ils fournissent la défense optimale contre les infections causées par des bactéries capsulées comme le méningocoque, le pneumocoque ou Haemophilus influenzae de type b1. Les vaccins glycococonjugates sont faits de polysaccharides bactériens purifiés qui forment les capsules de bactéries ou d’oligosaccharides synthétiques qui imitent ces polysaccharides exprimés en surface2, qui sont covalents liés à une protéine porteuse. La présence d’une protéine porteuse est essentielle pour favoriser les réponses immunitaires humoristiques protectrices dirigées contre le déterminant antigénique exprimé par les antigènes de hydrate decarbone 3. Outre une sélection et une production minutieuses de l’antigène médicide, les caractéristiques connues pour exercer une influence sur l’efficacité d’un vaccin glycoconjugate sont les suivantes : la nature de la protéine porteuse, la chimie de conjugaison (y compris la nature et la longueur du lien s’il est utilisé), ou le rapport saccharide/protéine3. De toute évidence, les positions auxquelles le saccharide est conjugué à la protéine ainsi que le nombre de points de connectivité sont pertinents pour l’immunogénicité. À ce jour, ces deux paramètres n’ont guère été étudiés parce que la préparation des glycoconjugates reste largement empirique. Leur synthèse repose habituellement sur l’utilisation de fonctions d’acide amine ou carboxylique de lysine ou de résidus de chaîne latérale aspartique/glutamique présents sur la séquence des protéines porte-avions. Cela conduit non pas à un seul, mais à un mélange hétérogène de glycoconjugates.
Jouer sur la réactivité, l’accessibilité ou la distribution des résidus d’acides aminés dans la protéine donne lieu à des glycoconjugates plus définis qui sont plus fiables pour documenter l’effet de la connectivité saccharide/protéine4. Un pas en avant vers cet objectif peut être atteint en appliquant la technologie de couplage glycan de protéine, un processus recombinant qui permet la production des vaccins contrôlés de glycoconjugate dans les usines cellulaires5,6. Cependant, la glycosylation a lieu exclusivement à un résidu d’asparagine dans les séquons D/EXNYS/T (auquel cas X est l’un des 20 acides aminés naturels), non naturellement présents sur les protéines porteuses.
La mutagenèse sélective du site et en particulier l’incorporation de cystéines pour exploiter leur réactivité hautement et sélective apparaît comme une alternative7,8. La production de protéines porteuse intégrant des UUA dans leur séquence peut offrir encore plus de souplesse pour la préparation homogène du vaccin glycoconjugate. Plus de 100 AUA ont été développés et incorporés dans diverses protéines9,10. Beaucoup d’entre eux contiennent des fonctions bioorthogonales habituellement utilisées pour effectuer des modifications post-translationnelles11 ou pour greffer des sondes biophysiques12 oudes médicaments 13, mais qui sont des poignées idéales pour une conjugaison plus approfondie avec les antigènes glucides. Des exemples réussis ont été revendiqués par Biotech14 en utilisant la synthèse des protéines sans cellules15, mais la préparation des vaccins glycoconjugate selon cette stratégie attend toujours d’être popularisée.
L’application de la stratégie in vivo pour la production de protéines porteuse mutées nécessite une machine translationnelle modifiée qui comprend un codon spécifique, un ARN reconnaissant le codon et une synthétase aminoacyl-tRNA (aaRS) qui catalyse spécifiquement le transfert de l’UAA sur l’ARN t (Figure 1)16. La suppression de codon d’arrêt d’ambre de pyrrolysine est l’une des méthodes les plus employées pour incorporer UAA, en particulier le propargyl-lysine (PrK)17. Ce dernier peut à son tour réagir avec des haptens de glucides fonctionnalisés à l’azido pour fournir des glycococonjugates entièrement définis et homogènes. Dans le présent manuscrit, nous décrivons comment synthétiser le propargyl-L-lysine, un UAA portant une poignée d’alkyne, comment l’incorporer dans une protéine cible lors de sa traduction dans une bactérie et enfin comment effectuer la conjugaison entre la protéine modifiée et un hapten portant une fonction d’azide à l’aide de la chimie du clic.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mutagenèse dirigée par le site est une stratégie simple visant à incorporer des acides aminés spécifiques à une position définie d’une protéine qui reste à peine utilisée dans le but de préparer des vaccins glycoconjugate7,8,14. La mutagenèse classique basée sur l’approche des 20 acides aminés naturels est très efficace puisqu’aucune modification des machines de traduction n’est nécessaire. Les mutati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.C. remercie le soutien financier de La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program « BioSynProt »), en particulier une bourse doctorale à T.V. Nous reconnaissons également le Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, France) pour ses précieux conseils techniques.
Materials
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
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