Glicoconi coniugato omogeneo prodotto dall'incorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale
Summary
L’espansione del codice genetico viene applicata per l’introduzione di un amminoacido innaturale che porta un gruppo funzionale biorthogonale su una proteina portante in un sito definito. La funzione biorthogonale viene ulteriormente utilizzata per l’accoppiamento site-selective di un antigene di carboidrati per fornire un vaccino glicoconi coniugato omogeneo.
Abstract
L’espansione del codice genetico è un potente strumento per introdurre amminoacidi innaturali (UAA) nelle proteine per modificarne le caratteristiche, studiare o creare nuove funzioni proteiche o avere accesso ai coniugati proteici. Fermare la soppressione del codone, in particolare la soppressione del codone ambrato, è emerso come il metodo più popolare per introdurre geneticamente gli UAA in posizioni definite. Questa metodologia è applicata alla preparazione di una proteina portante contenente una UAA che ospita un gruppo funzionale bioorthogonale. Questo manico reattivo può essere successivamente utilizzato per innestare in modo specifico ed efficiente un oligosaccaride sintetico hapten per fornire un vaccino omogeneo glicoconi coniugato. Il protocollo è limitato alla sintesi dei glicoconi coniugati in un rapporto 1:1 di carboidrati hapten/proteina portante ma suscettibile a numerose coppie di gruppi funzionali biorthogonali. L’omogeneità del vaccino glicoconi coniugato è un criterio importante per garantire una caratterizzazione fisico-chimica completa, soddisfacendo così sempre più esigenti le raccomandazioni delle agenzie di regolamentazione dei farmaci, un criterio che non è soddisfatto dalle classiche strategie di coniugazione. Inoltre, questo protocollo consente di ottimizzare finemente la struttura dell’attuale vaccino coniugato, dando origine a strumenti per affrontare le relazioni struttura-immunogenicità.
Introduction
I vaccini glicoconi coniugati sono elementi essenziali dell’arsenale vaccinale disponibile per il trattamento profilattico delle malattie infettive. Sono sicuri, ben tollerati ed efficienti in un’ampia fascia d’età, compresi i bambini piccoli. Forniscono la difesa ottimale contro le infezioni causate da batteri capsulati come meningococco, pneumococco o Haemophilus influenzae di tipo b1. I vaccini glicoconi coniugati sono fatti di polisaccaridi batterici purificati che formano le capsule di batteri o oligosaccaridi sintetici che imitano questi polisaccaridi espressi insuperficie 2, che sono covalentemente collegati a una proteina portante. La presenza di una proteina portante è essenziale per promuovere risposte immunitarie umoriche protettive dirette contro il determinante antigenico espresso dagli antigeni dei carboidrati3. Oltre a un’attenta selezione e produzione dell’antigene dei carboidrati, le caratteristiche note per esercitare un’influenza sull’efficacia di un vaccino glicoconi coniugato sono: la natura della proteina portante, la chimica coniugazione (compresa la natura e la lunghezza del linker se usato), o il rapporto saccaride / proteina3. Ovviamente, le posizioni in cui il saccaride è coniugato alla proteina e il numero di punti di connettività sono rilevanti per l’immunogenicità. Ad oggi, questi due parametri sono stati appena studiati perché la preparazione dei glicoconi coniugati rimane in gran parte empirica. La loro sintesi di solito si basa sull’uso di funzioni di ammina o acido carbossilico rispettivamente di lysine o residui della catena laterale dell’acido aspartico / glutammico presenti sulla sequenza proteica portante. Questo porta non a un singolo ma a una miscela eterogenea di glicoconi coniugati.
Giocare sulla reattività, l’accessibilità o la distribuzione dei residui di amminoacidi nella proteina dà origine a glicoconi coniugati più definiti che sono più affidabili per documentare l’effetto della connettività saccharide /proteina 4. Un passo avanti verso questo obiettivo può essere raggiunto applicando la tecnologia di accoppiamento del glico proteico, un processo ricombinante che consente la produzione di vaccini glicoconi coniugati controllati nelle fabbriche dicellule 5,6. Tuttavia, la glicosilazione avviene esclusivamente con un residuo di asparagina all’interno dei sequoni D/EXNYS/T (per cui X è uno dei 20 amminoacidi naturali), non naturalmente presente sulle proteine portanti.
La mutagenesi selettiva del sito e in particolare l’incorporazione delle cisteine per sfruttarne la reattività altamente e selettiva appare comealternativa 7,8. La produzione di proteine portanti che incorporano UAA nella loro sequenza può offrire ancora più flessibilità per la preparazione omogenea del vaccino glicoconi coniugato. Più di 100 UAA sono stati sviluppati e ulteriormente incorporati in varie proteine9,10. Molti di essi contengono funzioni bioorthogonali solitamente utilizzate per effettuare modifiche post trasizionali11 o per innestare sonde biofisiche12 o farmaci13, ma che sono maniglie ideali per un’ulteriore coniugazione con antigeni di carboidrati. Esempi di successo sono stati rivendicati da Biotech14 utilizzando la sintesi proteica priva di cellule15, ma la preparazione di vaccini glicoconi coniugati secondo questa strategia aspetta ancora di diventare popolare.
L’applicazione della strategia in vivo per la produzione di proteine portanti mutate necessita di un macchinario traslazionale modificato che includa un codone specifico, un tRNA che riconosca il codone e un amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) che catalizza specificamente il trasferimento dell’UAA sul tRNA (Figura 1)16. La soppressione del codone di arresto dell’ambra pirrolisina è uno dei metodi più utilizzati per incorporare la UAA, in particolare la propargil-llysina (PrK)17. Quest’ultimo può a sua volta reagire con haptens di carboidrati funzionalizzati all’azido per fornire glicoconi coniugati completamente definiti e omogenei. Nel presente manoscritto descriviamo come sintetizzare la propargyl-L-lisina, una UAA che porta una maniglia di alchine, come incorporarla in una proteina bersaglio durante la sua traduzione in un batterio e infine come eseguire la coniugazione tra la proteina modificata e un hapten che porta una funzione di azide usando la chimica dei clic.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mutagenesi site-directed è una strategia semplice per incorporare aminoacidi specifici in una posizione definita di una proteina che rimane a malapena utilizzata con l’obiettivo di preparare vaccini glicoconi coniugati7,8,14. La mutagenesi classica basata sull’approccio dei 20 amminoacidi naturali è altamente efficiente poiché non è richiesta alcuna modifica della macchina di traslazione. Le mutazioni della cisteina sono …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.C. riconosce con gratitudine il sostegno finanziario di La Région Pays de la Loire (Programma Pari Scientifique “BioSynProt”), in particolare una borsa di dottorato a T.V. Riconosciamo anche il Dott. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Tolosa, Francia) per i suoi preziosi consigli tecnici.
Materials
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
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