Homogen glykokonjugat produsert av kombinert unaturlig aminosyre inkorporering og klikk-kjemi for vaksineformål

Summary

Genetisk kodeutvidelse brukes for innføring av en unaturlig aminosyre som bærer en biorthogonal funksjonell gruppe på et bærerprotein på et definert sted. Biorthogonalfunksjonen brukes videre til den stedselektive koblingen av et karbohydratantigen for å gi en homogen glykokonjugatvaksine.

Abstract

Genetisk kodeutvidelse er et kraftig verktøy for å introdusere unaturlige aminosyrer (UAAer) i proteiner for å endre sine egenskaper, for å studere eller skape nye proteinfunksjoner eller å ha tilgang til proteinkonjugater. Stopp codon undertrykkelse, spesielt amber codon undertrykkelse, har dukket opp som den mest populære metoden for å genetisk introdusere UAAs på definerte stillinger. Denne metodikken brukes her på utarbeidelsen av et bærerprotein som inneholder en UAA som huser en bioorthogonal funksjonell gruppe. Dette reaktive håndtaket kan deretter brukes til å spesifikt og effektivt transplantere en syntetisk oligosakkarid hapten for å gi en homogen glykoconjugate vaksine. Protokollen er begrenset til syntesen av glykokonjugater i et 1:1 karbohydrat hapten / bærer proteinforhold, men mottagelig for mange par biorthogonale funksjonelle grupper. Glykokonjutere vaksine homogenitet er et viktig kriterium for å sikre fullstendig fysikalisk-kjemisk karakterisering, og dermed tilfredsstille flere og flere krevende narkotika regulatoriske byrå anbefalinger, et kriterium som er udekket av klassiske bøyningsstrategier. Videre gjør denne protokollen det mulig å finjustere strukturen til den faktiske konjugatvaksinen, noe som gir opphav til verktøy for å håndtere struktur-immunogenitetsrelasjoner.

Introduction

Glycoconjugate vaksiner er viktige elementer i vaksinearsenalet tilgjengelig for profylaktisk behandling av smittsomme sykdommer. De er trygge, godt tolerert og effektive i en bred aldersgruppe, inkludert små spedbarn. De gir optimalt forsvar mot infeksjoner forårsaket av kapsulerte bakterier som meningokokker, pneumokokker eller Haemophilus influenzae type b¹. Glykokonjutere vaksiner er laget av rensede bakterielle polysakkarider som danner kapslene av bakterier eller syntetiske oligosakkarider som etterligner disse overflateutpressede polysakkarider², som er kovalent knyttet til et bærerprotein. Tilstedeværelsen av et bærerprotein er viktig for å fremme beskyttende humorale immunresponser rettet mot den antigene determinanten uttrykt av karbohydratantigenene³. Bortsett fra et nøye utvalg og produksjon av karbohydratantigenet, er funksjonene som er kjent for å utøve innflytelse på effekten av en glykoconjugate vaksine: arten av bærerproteinet, bøyningkjemien (inkludert arten og lengden på linkeren hvis den brukes), eller sakkarid /^{proteinforholdet 3}. Selvfølgelig er posisjonene der sakkaridet er konjugert til proteinet, samt antall tilkoblingspunkter relevante for immunogenitet. Til dags dato har disse to parametrene knapt blitt studert fordi utarbeidelsen av glykokonjugatene forblir i stor grad empiriske. Deres syntese er vanligvis avhengig av bruk av amin eller karboksylsyre funksjoner av henholdsvis lysin eller aspartic / glutaminsyre sidekjede rester som finnes på bærer protein sekvens. Dette fører ikke til en enkelt, men til en heterogen blanding av glykokonjugater.

Å spille på reaktivitet, tilgjengelighet eller distribusjon av aminosyrerester i proteinet gir opphav til mer definerte glykokonjugater som er mer pålitelige for å dokumentere effekten av sakkarid / proteintilkobling⁴. Et skritt fremover mot dette målet kan oppnås ved å bruke proteinglykotankoblingsteknologi, en rekombinant prosess som gjør det mulig å lage kontrollerte glykokonjutere^{vaksiner i cellefabrikker 5,6}. Glykosyleringen foregår imidlertid utelukkende ved en asparaginrester i D/EXNYS/T-sequons (der X er noen av de 20 naturlige aminosyrene), som ikke er naturlig tilstede på bærerproteinene.

Nettstedet selektiv mutagenesis og spesielt inkorporering av cysteiner for å utnytte sin svært og selektiv reaktivitet vises som et alternativ^7,8. Produksjon av bærerproteiner som omfatter UAAer i deres sekvens kan gi enda mer fleksibilitet for homogen glykokonjugering av vaksinepreparat. Mer enn 100 UAAs har blitt utviklet og videre innlemmet i ulike^{proteiner 9,10}. Mange av dem inneholder bioorthogonale funksjoner som vanligvis brukes til å utføre post translasjonelle^{modifikasjoner 11} eller for å pode biofysiske sonder¹² eller narkotika^13, men som er ideelle håndtak for videre bøyning med karbohydratantigener. Vellykkede eksempler har blitt hevdet av Biotech¹⁴ ved hjelp av cellefri proteinsyntese^15, men utarbeidelse av glykokonjugatvaksiner i henhold til denne strategien venter fortsatt på å bli popularisert.

Anvendelse av in vivo strategi for produksjon av mutert bærer protein trenger en modifisert translasjonell maskineri som inkluderer en bestemt kodon, en tRNA gjenkjenne kodon og en aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) som spesielt katalyserer overføringen av UAA på tRNA (Figur 1)¹⁶. Pyrrolysin amber stop codon undertrykkelse er en av de mest brukte metodene for å innlemme UAA, spesielt propargyl-lysin (PrK)¹⁷. Sistnevnte kan igjen reagere med aziido-funksjonaliserte karbohydrat haptens å gi fullt definerte, homogene glykokonjugater. I det nåværende manuskriptet beskriver vi hvordan man syntetiserer propargyl-L-lysinen, en UAA som bærer et alkynehåndtak, hvordan man innlemmer det i et målprotein under oversettelsen i en bakterie og til slutt hvordan man utfører bøyning mellom det modifiserte proteinet og en hapten som bærer en azidefunksjon ved hjelp av klikkkjemi.

Protocol

1. Syntese av UAA: propargyl-lysin (PrK) Syntese av Nα-Boc-propargyl-lysin18 Oppløs 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) i en blanding av vandig 1 M NaOH (5 ml) og THF (5 ml) i en kolbe og monter kolben med silisiumsepum. Avkjøl kolben i et isbad og tilsett deretter 158 μL propargylklorformat (1,62 mmol) dropwise (over en 2-3 min periode) ved hjelp av en mikrosyring under omrøring. Varm reaksjonsblandingen til romtemperatur og fortsett å…

Representative Results

I dette prosjektet ble en homogen glykoconjugate vaksine utarbeidet ved hjelp av amber stop codon undertrykkelse strategi for å introdusere en UAA på et definert sted (Figur 1). Pneumoccocal overflateadhesin A ble valgt som bærer protein moiety. Dette proteinet er svært bevart og uttrykt av alle stammer av Streptococcus pneumoniae22. Det er svært immunogent og tidligere brukt som bærer i pneumokokkvaksineformuleringer<su…

Discussion

Stedsrettet mutagenese er en enkel strategi for å innlemme spesifikke aminosyrer i en definert posisjon av et protein som forblir knapt brukt med sikte på å forberede glykokonjugatvaksiner^7,8,14. Klassisk mutagenese basert på 20 naturlige aminosyrer tilnærming er svært effektiv siden ingen endring av oversettelse maskiner er nødvendig. Cystein mutasjoner er vanligvis rettet mot å utforske den unike tiol reaktivitet enten…

Materials

AIM (autoinductif medium)	Formedium	AIMLB0210	Solid powder
Boc-Lys-OH	Alfa-Aesar	H63859	Solid powder
BL21(DE3)	Merck Novagen	69450	E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin	Machery Nagel	Protino	Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH	this study		same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT	this study		pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid	gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)		plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate	Sigma-Aldrich	460923	Liquid
Sonicator	Thermo Fisher	FB120-220