Genetisk kodexpansion tillämpas för införande av en onaturlig aminosyra som bär en biortsfunktionell grupp på ett bärarprotein på ett definierat ställe. Biorthogonalfunktionen används vidare för den platsselektiva kopplingen av ett kolhydratantigen för att ge ett homogent glykokonjugatvaccin.
Genetisk kodexpansion är ett kraftfullt verktyg för att introducera onaturliga aminosyror (UAA) i proteiner för att ändra sina egenskaper, att studera eller skapa nya proteinfunktioner eller för att få tillgång till proteinkonjuger. Stoppa kodondämpning, i synnerhet bärnstensfärgad kodondämpning, har dykt upp som den mest populära metoden för att genetiskt introducera UAAs vid definierade positioner. Denna metod är häri tillämpas på framställning av en bärare protein som innehåller en UAA hyser en bioorthogonal funktionell grupp. Detta reaktiva handtag kan nästa användas för att specifikt och effektivt ympa en syntetisk oligosackarid hapten för att ge ett homogent glykokonjugatvaccin. Protokollet är begränsad till syntesen av glykokonjugat i en 1:1 kolhydrater hapten/carrier protein förhållandet men mottagliga för ett flertal par av biorthogonal funktionella grupper. Glycococonjugate vaccin homogenitet är ett viktigt kriterium för att säkerställa fullständig fysikalisk-kemisk karakterisering, därmed uppfyller fler och mer krävande läkemedel tillsynsmyndigheten rekommendationer, ett kriterium som inte uppfylls av klassisk konjugation strategier. Dessutom gör detta protokoll det möjligt att finjustera strukturen på det faktiska konjugatvaccinet, vilket ger upphov till verktyg för att ta itu med struktur-immunogenicitetsrelationer.
Glykokonjugatvaccin är väsentliga delar av vaccinarsenalen som finns för profylaktisk behandling av infektionssjukdomar. De är säkra, väl tolererade och effektiva i en bred åldersgrupp inklusive unga spädbarn. De ger det optimala försvaret mot infektioner orsakade av capsulated bakterier som meningokocker, pneumococcus eller Haemophilus influenzae typ b1. Glykokonjugatvaccin är tillverkade av renat bakteriella polysackarider som bildar kapslarna av bakterier eller syntetiska oligosackarider som efterliknar dessa yttexade polysackarider2, som är kovalent kopplade till ett bärarprotein. Förekomsten av ett bärare protein är avgörande för att främja skyddande humorala immunsvar riktade mot den antigena determinanten uttryckt av kolhydratanterna3. Bortsett från ett noggrant urval och produktion av kolhydratantigenen, är de funktioner som är kända för att utöva ett inflytande på effekten av ett glykopkonjugatvaccin: arten av bärarproteinet, konjugationskemin (inklusive arten och längden på länkaren om den används), eller saccharid-/proteinförhållandet3. Uppenbarligen är de positioner där sackarden är konjugerad till proteinet samt antalet anslutningspunkter relevanta för immunogenicitet. Hittills har dessa två parametrar knappast studerats eftersom beredningen av glykokonjugaterna förblir till stor del empirisk. Deras syntes bygger vanligtvis på användning av amin eller karboxylsyra funktioner av, respektive, lysin eller apartic / glutaminsyra side-chain rester som finns på bärare proteinsekvens. Detta leder inte till en enda utan till en heterogen blandning av glykokonjugat.
Att spela på reaktiviteten, tillgängligheten eller fördelningen av aminosyraresterna i proteinet ger upphov till mer definierade glykkonjugat som är mer tillförlitliga för att dokumentera effekten av saccharid/proteinanslutning4. Ett steg framåt mot detta mål kan uppnås genom att tillämpa protein glycan kopplingsteknik, en rekombinant process som möjliggör produktion av kontrollerade glykokonjugat vacciner i cell fabriker5,6. Glykosylering sker dock uteslutande vid en asparaginrester inom D/EXNYS/T sequons (varvid X är någon av de 20 naturliga aminosyrorna), inte naturligt närvarande på bärarproteinerna.
Site selektiv mutagenes och i synnerhet införlivande av cysteiner att utnyttja deras mycket och selektiv reaktivitet visas som ett alternativ7,8. Produktion av bärarproteiner som innehåller UAAs i deras sekvens kan erbjuda ännu mer flexibilitet för homogen glykolkonjugat vaccinpreparation. Mer än 100 UAAs har utvecklats och ytterligare införlivas i olika proteiner9,10. Många av dem innehåller bioorthogonal funktioner som vanligtvis används för att utföra efter translationella ändringar11 eller att ympa biofysiska sonder12 eller läkemedel13 men som är idealiska handtag för ytterligare konjugation med kolhydrater antigener. Framgångsrika exempel har hävdats av Biotech14 med hjälp av cellfriproteinsyntes 15 men beredning av glykokonjugat vacciner enligt denna strategi väntar fortfarande på att bli populariserade.
Tillämpning av in vivo-strategin för framställning av muterat bärarprotein behöver en modifierad translationell maskinpark som innefattar ett specifikt kodon, ett tRNA som känner igen kodon och en aminoacyl-tRNA-synthetase (aaRS) som specifikt katalyserar överföringen av UAA på tRNA (Figur 1)16. Den pyrrolysin bärnsten stop kodon dämpning är en av de mest använda metoderna för att införliva UAA, i synnerhet propargyl-lysin (PrK)17. Den senare kan i sin tur reagera med azido-functionalized kolhydrater haptens att ge fullt definierade, homogena glykokonjugat. I det föreliggande manuskriptet beskriver vi hur man syntetisera propargyl-L-lysin, en UAA som bär ett alkynehandtag, hur man införlivar det i ett målprotein under dess översättning i en bakterie och slutligen hur man utför konjugation mellan det modifierade proteinet och en hapten som bär en azidefunktion med hjälp av klickkemi.
Plats-riktad mutagenes är en enkel strategi för att införliva specifika aminosyror vid en definierad position av ett protein som förblir knappt används med syfte att förbereda glykokonjugat vacciner7,8,14. Klassisk mutagenes baserad på de 20 naturliga aminosyror strategi är mycket effektiv eftersom ingen ändring av översättningen maskiner krävs. Cystein mutationer är oftast riktade att ytterligare utforska den unika…
The authors have nothing to disclose.
E.C. erkänner tacksamt det ekonomiska stödet från La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique-programmet “BioSynProt”), i synnerhet ett doktorandstipendium till T.V. Vi erkänner också Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankrike) för hans dyrbara tekniska råd.
AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
Dialysis membrane | |||
DNAseI | |||
Filter 0.45 µm | |||
L-arabinose | |||
lysozyme | |||
Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
Pall centrifugal device | |||
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |