质谱导览基因组挖掘作为发现新天然产品的工具

Summary

这里建立了一个质谱仪指导基因组挖掘协议并对此进行描述。它基于基因组序列信息和LC-MS/MS分析，旨在促进从复杂的微生物和植物提取物的分子的识别。

Abstract

天然产品所覆盖的化学空间是巨大的，而且被广泛地未被识别。因此，需要方便的方法对其在性质和潜在的人类利益（例如，药物发现应用）的功能进行广泛的评估。该协议描述了基因组挖掘 （GM） 和分子网络 （MN） 的组合，这两种现代方法将全基因组测序中的基因簇编码注释与粗代谢提取物的化学结构特征相匹配。这是发现新的自然实体的第一步。这些概念，当一起应用，在这里被定义为MS引导基因组挖掘。在此方法中，主要组件以前被指定（使用 MN），并且与结构相关的新候选项与基因组序列注释（使用 GM）相关联。将GM和MN结合是一种有利可图的策略，旨在瞄准新的分子骨干或收获代谢特征，以便识别已知化合物中的类似物。

Introduction

二次代谢的研究通常包括筛选特定生物活动的粗提取物，然后对属于活性馏分的成分进行纯化、识别和表征。事实证明，这一过程是有效的，促进了若干化学实体的隔离。然而，现在这被认为是不可行的，主要是因为高的重新发现率。由于制药业在不了解特殊代谢物的作用和功能的情况下进行了革命，其鉴定是在实验室条件下进行的，没有准确代表自然^1。今天，人们更好地了解了自然信号的影响、分泌，以及大多数目标在检测出的低浓度下的存在。此外，对这一过程的监管将有助于学术界和制药业利用这一知识。它还将有利于与沉默生物合成基因簇（BGCs）2相关的代谢物的直接分离研究。²

在此背景下，基因组测序的进步重新产生了对筛选微生物代谢物的兴趣。这是因为分析未发现的生物合成簇的基因组信息可以揭示基因编码在实验室条件下未观察到或生产的新化合物。许多微生物全基因组项目或草案今天可用，而且数量每年都在增长，这为通过基因组挖掘^33、44发现新的生物活性分子提供了巨大的前景。

生物合成基因簇图集是目前最大的自动挖掘基因簇集合，作为联合基因组研究所（JGI IMG-ABC）2集成微生物基因组平台的组成部分。²最近，生物合成基因簇（MIBiG）标准化倡议的最低信息促进了BPC的手动再注释，提供了高度精心策划的参考数据集^5。如今，大量的工具可用于计算挖掘遗传数据及其与已知次生代谢物的连接。还制定了不同的策略，以获取新的生物活性天然产品（即异构表达、靶基因删除、体外重组、基因组序列、同位素引导筛选[基因同位素方法]、操纵本地和全球监管机构、基于抗药性的采矿、培养独立采矿，以及最近MS引导/编码方法^2,2、6、7、8、9。^6,7,8,9,1010、11、12、13、14、15。^{,11,12,13,14,15}

基因组挖掘作为一种单一策略，需要努力对单个或一小群分子进行批批;因此，在将新化合物列为隔离和结构阐明的优先位置的过程中仍然存在差距。原则上，这些方法每次实验只针对一种生物合成途径，从而导致缓慢发现速度。从这个意义上说，使用转基因和分子网络方法是天然产品研究的一个重要进步^{14，15。14,}

液相色谱-质谱（LC-MS）的多功能性、准确性和高灵敏度使其成为复合鉴定的好方法。目前，几个平台已经投资算法和软件套件的无目标代谢组16，17，18，19，20。^{16,17,18,19,20}这些程序的核心包括特征检测（峰值选取^）21和峰值对齐，这允许在一批样本中匹配相同的特征并搜索模式。基于MS模式的算法^22，23,23比较特征破碎模式，匹配MS²的相似性，生成共享结构特征的分子族。这些特征可以突出和聚类，赋予快速发现已知和未知的分子从复杂的生物提取物通过串联MS2，24，25^2,24,25的能力。因此，串联MS是一种多功能方法，用于同时获取大量数据中包含的几种化学型的结构信息。

全球天然产物社会分子网络^（GNPS）26算法使用规范化片段离子强度来构造多维向量，其中相似性使用原成函数进行比较。不同父离子之间的关系在关系图表示形式中绘制，其中每个碎片都可视化为节点（圆），每个节点的相关性由边缘（线）定义。单一来源分子的全球可视化被定义为分子网络。结构上分裂分子，独特的碎片将形成自己的特定簇或星座，而相关分子聚集在一起。聚类化学型允许假设其生物合成起源类似的结构特征连接。

在建立BGC及其小分子产品^之间的生物信息学联系时，将化学型到基因型和基因型到化学型的方法结合起来是强大的。因此，MS引导基因组挖掘是一种快速方法和低耗材料策略，它有助于在不同代谢和环境条件下，WGS揭示的一个或多个菌株的母离子和生物合成途径。

该协议的工作流程（图1）包括将WGS数据输入生物合成基因簇注释平台，如反SMASH28、29、30。^28,29,30它有助于估计由基因组编码的化合物和化合物的种类。必须采用一种以生物合成基因簇为目标的策略，编码感兴趣的化学实体，并分析含有BGC的野生型菌株和/或异质菌株的培养提取物，以利用GNPS^26、31,31的相似性生成聚类离子。因此，可以识别与目标 BGC 关联的新分子，并且数据库中不可用（主要是未知的类似物，有时以低脚点生成）。考虑用户可以为这些平台做出贡献，并且生物信息学和 MS/MS 数据的可用性正在迅速增加，从而推动有效计算工具和算法的不断发展和升级，从而指导复杂提取物与分子的有效连接， 这是相关的。

图 1：整个工作流的概述。如图所示，说明了在所述 MS 引导基因组挖掘方法中涉及的生物信息学、克隆和分子网络步骤，以识别新的代谢物。请点击此处查看此图形的较大版本。

该协议描述了一个快速而高效的工作流程，将基因组挖掘和分子网络结合为天然产品发现管道的起点。尽管许多应用能够可视化一个网络中MS可检测分子的组成和关联性，但此处采用了几种来可视化结构相似的聚类分子。利用这一策略，成功鉴定了在链球菌孢菌剂2042代谢提取物中观察到的新型环丙肽产物。在基因组挖掘的指导下，对华利霉素进行全生物合成基因簇编码被识别和克隆成生产者菌株链球菌素M1146。最后，在MS模式分子网络之后，MS检测到的分子与负责其^生物成形的BPC相关。

Protocol

1. 生物合成基因簇的基因组挖掘 执行全基因组测序 （WGS） 作为选择用于 MS 引导基因组挖掘的生物合成基因簇 （BCG） 的第一步。感兴趣的菌株（细菌）的全基因组草案可以通过光明会MiSeq技术获得，使用以下高质量基因组DNA：猎枪TruSeqPCR免费库准备和NexteraMate配对库准备工具包33。注：测序后，可以使用纽布勒 v3.0（罗切， 454） 汇编程序（在 <https：//ngs.csr.uky.edu/Newble…

Representative Results

该协议成功地利用基因组挖掘、异构表达和MS引导/代码方法的组合来获取新的专用华霉素模拟分子。目标（Valinomycin ）的基因组到分子工作流在图8中表示。链球菌sp.CBMAI 2042草案基因组在silico中进行分析，然后确定VLM基因簇并将其转移到异质宿主。异质菌株和野生菌株采用适当的发酵条件，用乙酸乙酯进行分，并浓缩产生粗提取物。从该产品中，获取了MS/MS数据，以生…

Discussion

该协议的最大优点是能够快速去复制代谢特征，并将基因组信息与MS数据桥接，以阐明新分子的结构，特别是结构模拟^2。根据基因组信息，可以研究不同的天然产物化学型，如多基肽（PK）、非核糖类肽（NRP）和糖基化天然产物（GNP），以及神秘的BFC。 Metabolomic筛选可产生实验室条件下特定菌株产生的活性BGC轮廓和化学多样性的证据。因此，BGC 可以克隆，以直接生产与已知 BGC ?…

Materials

Acetonitrile	Tedia	AA1120-048	HPLC grade
Agar	Oxoid	LP0011	NA
Apramycin	Sigma Aldrich	A2024	NA
Carbenicillin	Sigma Aldrich	C9231	NA
Centrifuge	Eppendorf	NA	5804
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	C3175	NA
Column C18	Agilent Technologies	NA	ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902
Kanamycin	Sigma Aldrich	K1377	NA
Manitol P.A.- A.C.S.	Synth	NA	NA
Microcentrifuge	Eppendorf	NA	5418
Nalidixic acid	Sigma Aldrich	N4382	NA
Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F548S	NA
Q-TOF mass spectrometer	Agilent technologies	NA	6550 iFunnel Q-TOF LC/MS
Sacarose P.A.- A.C.S.	Synth	NA	NA
Shaker/Incubator	Marconi	MA420	NA
Sodium Chloride	Synth	NA	P. A. – ACS
Soy extract	NA	NA	NA
Sucrose	Synth	NA	P. A. – ACS
Thermal Cycles	Eppendorf	NA	Mastercycler Nexus Gradient
Thiostrepton	Sigma Aldrich	T8902	NA
Tryptone	Oxoid	LP0042	NA
Tryptone Soy Broth	Oxoid	CM0129	NA
UPLC	Agilent Technologies	NA	1290 Infinity LC System
Yeast extract	Oxoid	LP0021	NA