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유전학

아그로박테리움 뿌리줄기에의한 털이 많은 뿌리 유도 -타르타르 메밀의 매개 변형(파고피룸 타타리쿰)

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60828
, , , , , , , ,
1Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Artemisinin Research Center,China Academy of Chinese Medical Sciences, 3College of Life Science,Huaibei Normal University, 4Economic Crop Research Institute Sichuan Academy of Agriculture Sciences, 5Research Center of Buckwheat Industry Technology,Guizhou Normal University

Summary

우리는 아그로박테리움 뿌리줄기유전자-타르타르메밀(Fagopyrum tataricum)에서매개 변형된 변종에 의해 털이 많은 뿌리를 유도하는 방법을 설명합니다. 이 유전자 기능 및 타르타리 메밀에서 이차 대사 산물의 생산을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다., 어떤 유전 변환에 대 한 채택, 또는 개선 후 다른 약용 식물에 대 한 사용.

Abstract

타르타리 메밀 (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] 그것은 플라보노이드, 특히 루틴과 같은 풍부한 이차 대사 산물을 포함하기 때문에 다양한 생물학적 및 약리학적 활동을 가지고 있습니다. Agrobacterium 뿌리 줄기 유전자 유전자 기능을 조사 하 고 이차 대사 산물의 수율을 증가 하는 약용 식물에 털이 뿌리를 유도 하기 위해 전세계적으로 점차적으로 사용 되었습니다. 본 연구에서, 우리는 결핵에서 A. 근위축성-매개털뿌리를 생성하는 상세한 방법을 기술하였다. 7-10일 에서 코틸레톤 및 hypocotyledonary 축은 이식으로 선택되고 1 주 후에 나타난 모험적인 털이 뿌리를 유도하는 이진 벡터를 운반하는 A. 뿌리 줄기 유전자에 감염되었습니다. 생성된 털이 많은 뿌리 형질전환은 형태, 저항성 선택(kanamycin), 및 리포터 유전자 발현(녹색 형광 단백질)에 기초하여 확인되었다. 그 후, 변형 된 털이 뿌리는 필요에 따라 자기 전파되었다. 한편, 골수모세포증(MYB) 전사 인자 인, FtMYB116은 A. 뿌리줄기-매개된 털뿌리를 이용하여 결핵 게놈으로 변형되어 플라보노이드합성에서 FtMYB116의 역할을 검증하였다. 결과는 플라보노이드 관련 유전자의 발현 및 플라보노이드 화합물(루틴 및 케르세틴)의 수율이 FtMYB116에의해 촉진된 유의한(p&0.01)이었으며, 이는 A. rhizogenes-매개털이 뿌리가 유전자 기능 및 이차 대사 산물의 생산을 조사하는 효과적인 대체 도구로 사용될 수 있음을 나타낸다. 털이 많은 뿌리를 생성하기 위한 본 연구에서 기술된 상세한 단계별 프로토콜은 조정 후 임의의 유전적 변형 또는 다른 약용 식물에 대해 채택될 수 있다.

Introduction

타르타리 메밀(TB)(파고피룸타타리쿰(L.) 가에르트른)은 파고피룸 속과 가족다각과1에속하는 디코틸레돈의 일종이다. 한의학 상동성 식품의 일종으로, 결핵은 독특한 화학 성분과 질병에 대한 다양한 생체 활동으로 인해 상당한 관심을 받고 있습니다. 결핵은 주로 탄수화물, 단백질, 비타민 및 카로티노이드뿐만 아니라 페놀산 및 플라보노이드와 같은 폴리페놀이 풍부합니다1. 항산화,항고혈압제 2,항염증제, 항암 및 항당뇨 특성을 포함한 플라보노이드의 다양한 생물학적 및 약리학적 활동이3가지입증되었다.

아그로박테리움 뿌리줄기는 상처부위4,,5를감염시킴으로써 여러 고식물, 특히 디코틸레톤에서 털이 많은 뿌리질환의 발병에 기여하는 토양 세균이다. 이러한 과정은 뿌리 유도(Ri) 플라스미드5,,6에서 T-DNA의 전달에 의해 개시되고 일반적으로 리플라스미드로부터 의 외인성 유전자의 통합 및 발현및 털이 많은 뿌리 표현형을 생성하는 후속 단계를 수반한다.7 A. 뿌리 줄기-매개 형질 전환 털이 뿌리, 식물 생명 공학 분야에서 강력한 도구로, 가장 널리 때문에 그들의 안정적이고 높은 생산성과 짧은 기간에 쉽게 얻을 수 사용되었다. 더욱이, A. 뿌리줄기유전자에 의해 유도된 털이 많은 뿌리는 호르몬이 없는 배지에서 그들의 배기류 발달 및 고도로 분지성장에 의해 효율적으로 구별된다8. 그들은 인공 종자 생산, 뿌리 작은혹 연구를 포함하여 연구의 몇몇 필드에서 이용될 수 있고, 진균균균균, 선충 및 근병원체 와 같은 그밖 유기체와의 상호 작용을 공부하기에서7,,9. 또한, 털이 많은 뿌리 형질전환 배양물들은 생화학적 경로 및 화학적 신호질과 의약품, 화장품 및 식품 첨가물로서 사용되는 식물 이차 대사산물을 생산하기 위한 실험 시스템으로 광범위하게 사용되고 있다8,,10. 인돌 알칼로이드, 아코마이트, 트로판 알칼로이드, 테르페노이드 및 플라보노이드를 포함한 귀중한 이차 대사산물은 야생형 털뿌리에서 합성되어2,수십 년 동안 파낙스인삼11의인삼, 쿠마린12, 암미12,13,

털이 많은 뿌리는 27가구14종에서79종의 식물로 A. 뿌리줄기를 사용하여 생산되었다. 예를 들어, A. 뿌리 줄기-매개 털이 뿌리 변환 대두15,16, 살비아17, 플럼바 고 인디카18, 연꽃 japonicus19,그리고 치커리(Cichorium intybus L.), 20. 결핵 털이 뿌리 변환도 조사되었다2. A. 근위대 유전자에 의해 매개된 털이 많은 뿌리의 발달에 관하여 몇몇 상세한 프로토콜은 이진 벡터를 들고 있거나 하지 않습니다. 예를 들어, Sandra et al.21은 야생형 싹에서 지속되는 형질전환 감자 털이 많은 뿌리를 생산하는 방법을 도입하였다. 완전히 발달된 털이 많은 뿌리는 감자 식물의 줄기 인터노드로 거스 리포터 유전자를 운반하는 A. 뿌리줄기 유전자를 주사한 후 5-6주 후에 시각화될 수 있었다. 또 다른 연구는 또한 황마에 gusA 기자 유전자를 품고 A. 뿌리 줄기에 의해 유도 된 형질 전환 털이 뿌리 시스템을보고했다(코코러스 capsularis L.) 22.또한, Supaart 외23은 ThCA를 생성하기 위해 Δ 1-테트라하이드로칸나비놀산(THCA) 신타제의 유전자를 운반하는 발현 벡터 pBI121로 형질전환된 A. 뿌리줄기유전자를 이용하여 형질전환 담배 털뿌리를 수득하였다.1

그러나, 털이 뿌리 변환의 효과적인 생성을 위한 단계별 프로세스, 특히 결핵에서, 상대적으로 덜 입증 되었습니다. 본 연구에서는, 우리는 기자유전자(GFP),선택적마커(Kan),및 관심 유전자(b4) 및 관심유전자(b4)및 관심 유전자를 이용하여 상세한 프로토콜을 설명하였고, 우리 그룹에서 확인된 기본 나선-루프-나선(bHLH) 패밀리로부터 확인되지 않은 유전자는 결핵에서 털이 많은 뿌리 유전적 변형을 생성한다.bHLH 실험은 5-6 주 동안 지속, 씨앗의 접종에서 털이 뿌리의 생성에, 이식 준비를 포함, 감염, coculturing, subculturing, 및 후속 전파. 더욱이, A. 골수모세포증 전사인자(116)의 결핵 이식유전자를 운반하는 이진 플라스미드를 함유하는뿌리줄기유전자(FtMYB116)는 FTMYB116이 결핵에서 결핵 및 대사 수준에서 결핵에서 의 한 모발 기근 변환을 통해 플라보노이드, 특히 루틴의 축적을 촉진할 수 있는지 여부를 결정하는데 사용되었다. A. rhizogenes FtMYB116은빛 유도 전사 인자이며, 다른 빛 조건 하에서 루틴의 합성을조절한다 5. 찰콘신타제(CHS),플라바노네-3-하이드록실라제(F3H), 플라보노이드-3′-하이드록실라제(F3’H), 플라보놀HF3신타제(FLS)24는 루틴 생합성의 대사 경로에 관여하는 주요 효소이다.F3HFLS 따라서, 본 연구는 결핵 털이 많은 뿌리에서 FtMYB116의 과발현과 주요 효소 유전자의 발현뿐만 아니라 루틴 및 퀘르세틴과 같은 다른 플라보노이드의 함량을 입증한다.

Protocol

이 연구에 사용된 결핵은 BT18로 명명되었으며, 이는 산시 농업 과학 아카데미의 소규모 기타 곡물 연구 센터에서 재배한 “JinQiao No.2″의 품종에서 유래되었습니다. 이 프로토콜의 기본 단계는 그림 1에나와 있습니다. 참고: 이식 과 관련된 조작을 신속하게 운영하고 가능하면 페트리 접시를 닫아 서 시동및 오염을 피하십시오. 달리 명시되지 않는 한, 모든 …

Representative Results

아그로박테리움 뿌리줄기-매개 결핵 털뿌리 형질전환본 연구는 A. 뿌리줄기유전자를사용하여 유전적으로 변형된 털뿌리를 얻기 위해 설립된 단계별 프로토콜을 설명한다. 결핵 종자의 접종으로부터 확인된 털이 많은 뿌리를 수확하는 데 약 5-6주가 걸렸으며, 몇 가지 주요 단계는 그림1(A-H)에도시되어 있습니다. Figure 1 간단히, 멸균?…

Discussion

결핵은 유전 및 대사 수준1,,2,5,27,,28에서이차 대사 산물과 관련된 여러 연구에서 사용되어 왔다.5, 털이 많은 뿌리 문화는 대사 산물 생산을위한 고유 한 공급원으로, 대사 공학(29)에 중추적 인 역할을하고 관련 유전자를 삽입하여 신진 대사 경로를 변경하?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 중앙 공공 복지 연구 기관 ZXKT17002에 대한 기본 연구 기금에 의해 지원되었다.

Materials

2*Taq PCR MasterMix Aidlab, China PC0901
Agar powder Solarbio Life Science, Beijing, China A8190
Applied Biosystems 2720 thermo cycler ThermoFisher Scientific, US A37834
AS Solarbio Life Science, Beijing, China A8110 Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectors ThermoFisher Scientific (invitrogen), US / pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodium Solarbio Life Science, Beijing, China C8240 Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed micro Hitachi, Japan No. 90560201
Diposable Petri-dish Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China /
DYY-6C electrophoresis apparatus Bjliuyi, Beijing China ECS002301
EASYspin Plus Plant RNA Kit Aidlab, China RN38
ELGA purelab untra bioscience ELGA LabWater, UK 82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometer biotek, US /
Gateway BP/LR reaction enzyme ThermoFisher Scientific (invitrogen), US 11789100/11791110
HYG-C multiple-function shaker Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China /
Kan Solarbio Life Science, Beijing, China K8020 Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizer Sanyo, Japan /
MS salts with vitamins Solarbio Life Science, Beijing, China M8521
NaCl Solarbio Life Science, Beijing, China S8210
Other chemicals unstated Beijing Chemical Works, China ethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meter Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China a008
Plant Genomic DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD DP305
Rifampin Solarbio Life Science, Beijing, China R8010 Diluted in DMSO, 50 mg/mL
Spectinomycin Solarbio Life Science, Beijing, China S8040 Diluted in Water, 100 mg/mL
Sucrose Solarbio Life Science, Beijing, China S8270
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech, Beijing, China BM101-01
Tryptone Solarbio Life Science, Beijing, China LP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paper Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd /
Yeast Extract powder Solarbio Life Science, Beijing, China LP0021
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Mi, Y., Zhu, Z., Qian, G., Li, Y., Meng, X., Xue, J., Chen, Q., Sun, W., Shi, Y. Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum). J. Vis. Exp. (157), e60828, doi:10.3791/60828 (2020).
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